一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术的鞘氨醇胶裂解酶是由含有pET28a

【技术实现步骤摘要】
一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法。

技术介绍

[0002]微生物代谢胶也叫生物合成胶，是微生物产生的具有保护作用的一种生物高聚物。近年来研究者发现了包括结冷胶(Gellan gum,S
‑
60)、威兰胶(Welan gum,S
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130)、鼠李胶(Rhamsan gum,S
‑
194)、迪特胶(Diutan gum,S
‑
657)、S
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88、S
‑
198和NW
‑
11在内的多种鞘氨醇胶。它们一般都具有相似的主链结构，即葡萄糖
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葡萄糖醛酸
‑
葡萄糖
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X
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(X是L
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鼠李糖或L
‑
甘露糖)，被统称为鞘氨醇胶(Sphingans)。由于鞘氨醇胶多具有优良的流变学性质、热稳定性、酸碱稳定性等性能，可广泛应用于食品、混凝土、医药、石油等工农业生活的各个方面，已经引起越来越多的关注。鞘氨醇单胞菌WG(中国专利201410485635.5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013161)可以生产一种新型鞘氨醇胶WL，该多糖具有优于黄原胶、威兰胶的粘弹性、触变性、耐温性及耐盐性，在石油开采领域具有重要的应用价值。
[0003]但是，由于鞘氨醇胶WL分子量较大，分离纯化后难于重新溶解，限制了其应用，因此，需要对其进行降解，适度降低分子量。同时，鞘氨醇胶WL的流变学性能、耐温耐盐性及水溶性等性能均具有分子量依赖性，因此，制备不同分子量的鞘氨醇胶WL，可以获得适用于不同领域的多糖样品。目前，多糖降解多以化学降解方法为主，但化学降解条件要求较高，过程繁琐，也会导致降解过程中产物分离困难，产物分子量分布范围较宽等缺陷。采用生物酶解方法能够克服这些困难。但是，因为鞘氨醇胶结构的特殊性，专一性降解鞘氨醇胶的生物酶较少，采用生物降解法降解鞘氨醇胶的研究较少，生物酶解法降解鞘氨醇单胞菌WG生产的鞘氨醇胶WL国内外还未曾有过报道。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种鞘氨醇胶裂解酶及酶解鞘氨醇胶的制备方法。采用本专利技术的鞘氨醇胶裂解酶对鞘氨醇胶进行裂解克服了采用化学法制备不同分子量鞘氨醇胶过程中的耗能、分离困难、反应条件难以控制等缺陷。本专利技术方法制备的酶解鞘氨醇胶具备较好的羟基自由基清除活性，可用于食品、护肤品等领域，拓展了鞘氨醇胶的应用。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种鞘氨醇胶裂解酶，由以下方法制备而成：
[0007](1)将含有pET28a
‑
WelR重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到LB培养基中，37℃培养至OD
600
至0.6～1.0，加入终浓度为0.2
‑
5mM的IPTG进行诱导，在16
‑
30℃下诱导4
‑
20小时；
[0008](2)将步骤(1)诱导表达后的菌液离心收集菌体，用去离子水清洗两次，并重新悬
浮在pH为7.4的PBS缓冲液中，冰水浴超声破碎至菌体澄清，超声破碎后进一步离心取上清即得到鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液。
[0009]在上述方案的基础上，所述pET28a
‑
WelR重组质粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]上述鞘氨醇胶裂解酶在鞘氨醇胶裂解中的应用。
[0011]在上述方案的基础上，所述鞘氨醇胶由鞘氨醇单胞菌发酵产生。
[0012]在上述方案的基础上，所述鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌WG，保藏号为CCTCC No:M2013161。
[0013]一种酶解鞘氨醇胶的制备方法，采用上述鞘氨醇胶裂解酶进行酶解。
[0014]在上述方案的基础上，所述鞘氨醇胶裂解酶的用量为每mg鞘氨醇胶2
‑
10μL，酶解时间为10
‑
180min。
[0015]在上述方案的基础上，所述酶解鞘氨醇胶的制备方法，步骤如下：
[0016](1)将鞘氨醇胶溶于pH为7.4的PBS缓冲液中，搅拌过夜，使其充分溶解，配制鞘氨醇胶溶液；
[0017](2)将步骤(1)制备的鞘氨醇胶溶液与上述鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液同时升温至30℃；并将预热后的粗酶液加入预热后的鞘氨醇胶溶液中进行酶解反应，粗酶液的使用量为2
‑
10μL/mg底物；酶解反应温度为30℃，转速150r/min，pH为7.4，反应时间为10
‑
180min；
[0018](3)将步骤(2)酶解后的混合液升温至100℃，煮沸10min，使酶灭活，待冷却至室温；
[0019](4)将步骤(3)灭酶后的反应液于8000r/min离心15min，除去蛋白沉淀，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋进行透析，除去盐离子以及杂质，进行冷冻干燥，获得不同分子量的鞘氨醇胶WL样品。
[0020]上述方法制备的酶解鞘氨醇胶。
[0021]上述的酶解鞘氨醇胶在制备抗氧化制剂中的应用。
[0022]本专利技术技术方案的优点
[0023]采用本专利技术的鞘氨醇胶裂解酶对鞘氨醇胶进行裂解克服了采用化学法制备不同分子量鞘氨醇胶过程中的耗能、分离困难、反应条件难以控制等缺陷。本专利技术方法制备的鞘氨醇胶具备较好的羟基自由基清除活性，可用于食品、护肤品等领域，拓展了鞘氨醇胶的应用。
附图说明
[0024]图1鞘氨醇胶裂解酶诱导表达的SDS
‑
PAGE图(M：蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为170、130、100、70、55、40、35、25、15、10kDa，泳道1：阴性对照沉淀；泳道2
‑
3：重组菌株16℃诱导20h获得的沉淀；泳道4：阴性对照上清；泳道5：重组菌株OD
600
＝0.6时添加IPTG 16℃诱导20h获得的粗酶液；泳道6：重组菌株OD
600
＝1时添加IPTG 16℃诱导20h获得的粗酶液)；
[0025]图2不同酶用量酶解后鞘氨醇胶粘度保留率曲线；
[0026]图3酶解不同时间后鞘氨醇胶粘度保留率曲线；
[0027]图4不同分子量鞘氨醇胶的羟基自由基清除活性。
具体实施方式
[0028]在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0029]下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。
[0030]实施例1
[0031]一种鞘氨醇胶裂解酶的制备方法，步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鞘氨醇胶裂解酶，其特征在于，由以下方法制备而成：(1)将含有pET28a
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WelR重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到LB培养基中，37℃培养至OD
600
至0.6～1.0，加入终浓度为0.2
‑
5mM的IPTG进行诱导，在16
‑
30℃下诱导4
‑
20小时；(2)将步骤(1)诱导表达后的菌液离心收集菌体，用去离子水清洗两次，并重新悬浮在pH为7.4的PBS缓冲液中，冰水浴超声破碎至菌体澄清，超声破碎后进一步离心取上清即得到鞘氨醇胶裂解酶的粗酶液。2.根据权利要求1所述鞘氨醇胶裂解酶，其特征在于，所述pET28a
‑
WelR重组质粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。3.权利要求1或2所述鞘氨醇胶裂解酶在鞘氨醇胶裂解中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鞘氨醇胶由鞘氨醇单胞菌发酵产生。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌WG，保藏号为CCTCC No:M2013161。6.一种酶解鞘氨醇胶的制备方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述鞘氨醇胶裂解酶进行酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继乾，朱虎，李慧，李本超，徐海，姬思雪，常爱平，柳建林，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：