一种寡聚透明质酸钠的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种寡聚透明质酸钠的制备方法：可发酵产生透明质酸的菌种接入发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，发酵至动力粘度140000

【技术实现步骤摘要】
一种寡聚透明质酸钠的制备方法


[0001]本专利技术属于生物大分子发酵生产
，涉及一种寡聚透明质酸钠的制备方法，具有涉及一种在发酵过程中降解制备寡聚透明质酸钠的方法。

技术介绍

[0002]寡聚透明质酸钠相比常规分子量的透明质酸钠在保持较好的保湿特性的基础上还具有良好的透皮吸收特性和大分子透明质酸不具有的生物活性，广泛用于日用品中。常见寡聚透明质酸钠的制备方法有三大缺点，第一，传统透明质酸钠的发酵工艺，在发酵后期（10
‑
12g/L），因为粘度大搅拌困难导致传质传热困难等原因只能停止发酵，导致产量较低，在此基础上酶解透明质酸的成本也会增高。第二，以常规分子量透明质酸再投料进行酶解，溶液体积大，浓度小，生产成本高。第三，常见的两种方法得到固体成品困难：沉淀法体积大浪费大量原料酒精且收率低；喷雾干燥法虽然收率高，但是成品透明质酸钠颜色较差且含量较沉淀法低。

技术实现思路

[0003]为解决上述问题，本专利技术提供了一种高产量高活性定向分子量寡聚透明质酸钠的发酵制备方法。在透明质酸钠发酵过程中加入透明质酸水解酶，边发酵边酶解，将产量提高至14g/L左右，再经过二次酶解得到固定分子量的寡聚透明质酸钠。该方法提高了发酵产量且工艺连续，酶解后透明质酸的收率高，所得产品活性高。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0005]一种寡聚透明质酸钠的制备方法，包括以下步骤：（1）可发酵产生透明质酸的菌种接入发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，发酵至动力粘度140 000
‑
250 000 mPa
·
s时，添加透明质酸酶，至发酵终点获得发酵液；（2）调节发酵液的pH，在适温下加入透明质酸酶，反应获得酶解液；（3）酶解液中加入抗氧化剂，然后调节pH，升温灭活酶，获得寡聚透明质酸钠溶液；（4）将寡聚透明质酸钠溶液纯化、干燥获得寡聚透明质酸钠。
[0006]步骤（1）中，所述透明质酸酶添加量为30
‑
90AU/L发酵液。
[0007]所述发酵终点为pH变化小于0.05/min。
[0008]优选地，所述可发酵产生透明质酸的菌种选自兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
[0009]所述发酵培养基为适于透明质酸发酵，至少含有碳源、氮源、无机盐的发酵液。
[0010]步骤（2）中，所述pH为6.0
‑
7.5，所述适温为30
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45℃，优选为37
‑
40℃。
[0011]步骤（2）中，所述透明质酸酶的添加量根据目的产物的分子量和酶解时间进行调整。优选的，分子量段在5KDa
‑
10KDa，每kg HA添加酶60000
‑
120000AU；分子量段在3KDa
‑
5KDa，每kg HA添加酶120000
‑
150000AU；分子量段在800Da
‑
3KDa，每kg HA添加酶150000
‑
300000AU。
[0012]步骤（2）中，所述透明质酸酶的酶解时间为6
‑
9h。
[0013]步骤（1）和（2）中，所述透明质酸的来源不限，可以是水蛭来源的、动物来源的，如，水蛭、牛睾丸，也可以是微生物来源的，如重组工程菌发酵获得的。
[0014]步骤（3）中，所述抗氧化剂的浓度为0.1%
‑
0.2%w/v。所述抗氧化剂选自亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾和抗坏血酸及其衍生物中的一种或几种；优选为亚硫酸氢钠。
[0015]步骤（3）中，所述pH为4.5
‑
5.6。
[0016]步骤（3）中，所述升温的温度为80
‑
120℃，灭活时间为15
‑
60min。
[0017]优选的，步骤（4）中，所述纯化包括以下步骤：（i）寡聚透明质酸钠溶液过滤后，依次加入漂白剂和金属离子螯合剂调节pH进行反应，然后调节pH后进行过滤、浓缩，获得浓缩液；（ii）在浓缩液中加入氯化钠、调节pH，以乙醇溶液沉淀，沉淀洗涤后抽滤，获得纯品。
[0018]步骤（i）中，所述过滤的孔径为0.22
‑
0.45μm。
[0019]步骤（i）中，所述漂白剂的加入量为0.1%
‑
0.2% w/v。所述金属离子螯合剂的加入量为0.1%
‑
0.2%w/v。
[0020]步骤（i）中，所述漂白剂为次氯酸钠、双氧水或活性炭中的一种；优选为次氯酸钠。所述金属离子螯合剂为EDTA、EDTA二钠或EDTA二钾。
[0021]步骤（i）和（ii）中，所述pH均为6.0
‑
7.5。
[0022]步骤（i）中，所述浓缩优选为超滤浓缩，超滤的孔径为根据目的产品的不同而选择，如，分子量段在5KDa
‑
10KDa，可以使用500Da的超滤膜；分子量段在3KDa
‑
5KDa，可以使用300Da的超滤膜；分子量段在800Da
‑
3KDa，可以使用300Da的反渗透膜。
[0023]步骤（ii）中，所述氯化钠加入量为4%
‑
6%w/v。
[0024]步骤（ii）中，所述乙醇溶液浓度为90
‑
100%v/v。
[0025]步骤（ii）中，所述洗涤的溶剂为90
‑
100%v/v乙醇溶液。
[0026]一种上述制备方法获得的寡聚透明质酸钠。
[0027]本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的寡聚透明质酸钠的制备方法，在发酵过程中加入透明质酸水解酶，边发酵边酶解，将产量提高至14g/L，再经过二次酶解得到固定分子量的寡聚透明质酸钠；高温灭活过程中加入抗氧化剂保护透明质酸钠。该方法提高了发酵产量，酶解后透明质酸的收率高、工艺连续，直接获得目标分子量产物，所得产品活性高。
附图说明
[0028]图1是不同处理组模型组织形态。
具体实施方式
[0029]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0030]实施例1 5KDa
‑
10KDa透明质酸钠的制备（1）在40L发酵罐中，将兽疫链球菌接入30L发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，
发酵至动力粘度210 000 mPa
·
s时添加透明质酸酶1200AU，发酵至pH变化小于0.05/min，停止发酵，获得发酵液，硫酸咔唑法检测透明质酸钠含量为13.5g/L；（2）调节发酵液的pH为6.5，在37℃下加入透明质酸酶30000AU，反应7.5h获得酶解液；（3）酶解液冷至室温，加入60g亚硫酸氢钠，然后调节pH至4.5，升温至80℃保持30mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡聚透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）可发酵产生透明质酸的菌种接入发酵培养基中，适宜条件下搅拌发酵，发酵至动力粘度140 000
‑
250 000 mPa
·
s时，添加透明质酸酶，至发酵终点获得发酵液；（2）调节发酵液的pH，在适温下加入透明质酸酶，反应获得酶解液；（3）酶解液中加入抗氧化剂，然后调节pH，升温灭活酶，获得寡聚透明质酸钠溶液；（4）将寡聚透明质酸钠溶液纯化、干燥获得寡聚透明质酸钠。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述透明质酸酶添加量为30
‑
90AU/L发酵液；所述发酵终点为pH变化小于0.05/min；步骤（2）中，所述透明质酸酶的添加量为：产物分子量段在5KDa
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10KDa，60000
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120000AU/kg；产物分子量段在3KDa
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5KDa，120000
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150000AU/kg；产物分子量段在800Da
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3KDa，150000
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300000AU/kg；所述透明质酸酶的酶解时间为6
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9h。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可发酵产生透明质酸的菌种选自兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述pH为6.0
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7.5，所述适温为30
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45℃；步骤（3）中，所述pH为4.5
‑
5....

【专利技术属性】
技术研发人员：张建勇，俞超，王朋田，朱伟伟，刘守垒，田洪果，相茂功，王春朋，殷小崴，王海泉，秦会利，李昊，张朋，赵鹏，惠吉阳，王新志，郑成红，卢滢滢，
申请(专利权)人：山东众山生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：