肝微粒体孵育体系中睾酮及6β-羟基睾酮检测平台的建立方法和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β

【技术实现步骤摘要】
287.3，锥孔电压50V，碰撞电压20V；第五质谱条件为：离子对m/z 305.1
→
m/z 269.3，锥孔电压50V，碰撞电压22V；第六质谱条件为：离子对m/z 305.1
→
m/z 227.2，锥孔电压50V，碰撞电压30V；比较检测结果，得出6β
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羟基睾酮最优质谱条件；
[0016]步骤二、肝微粒体孵育体系中睾酮和6β
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羟基睾酮检测平台的建立
[0017]设置睾酮最优质谱条件以及6β
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羟基睾酮最优质谱条件，将睾酮系列浓度为0.5～500ng/mL的标准曲线样品采用LC
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MS/MS进样分析，得到睾酮线性回归方程和6β
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羟基睾酮线性回归方程。
[0018]作为优选，所述睾酮最优质谱条件为第一质谱条件。
[0019]作为优选，所述6β
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羟基睾酮最优质谱条件为第五质谱条件。
[0020]作为优选，所述LC
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MS/MS分析中液相色谱条件为：
[0021]流速：0.5mL/min；流动相A：含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱时长：1.5min；洗脱方式：梯度洗脱，总流速0.5mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度：4℃；进样体积：5μL；保留时间：睾酮1.1min，6β
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羟基睾酮0.9min，卡马西平1.2min。
[0022]进一步优选，所述LC
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MS/MS分析中梯度洗脱程序为：
[0023]0.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；
[0024]0.5min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；
[0025]1.0min，流动相A的体积百分比为10％，流动相B的体积百分比为90％；
[0026]1.2min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％；
[0027]1.5min，流动相A的体积百分比为90％，流动相B的体积百分比为10％。
[0028]作为优选，所述LC
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MS/MS分析中质谱条件为：
[0029]离子源：电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式；扫描方式：多反应检测扫描；碰撞气：9psi；气帘气：20psi；Resolution Q1/Q3：Unit/Unit；喷雾电压：5500v；离子化温度：500℃；分析时间：1.5min。
[0030]进一步优选，所述LC
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MS/MS分析中，所述睾酮的质谱条件为：Q1：289.4Da；Q3：109.1Da；时间：100ms；去簇电压：90V；碰撞电压：40V；碰撞室射出电压：15V；射入电压：10V；
[0031]所述6β
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羟基睾酮的质谱条件为：Q1：305.1Da；Q3：269.3Da；时间：100ms；去簇电压：50V；碰撞电压：22V；碰撞室射出电压：15V；射入电压：10V；
[0032]所述卡马西平的质谱条件为：Q1：237.1Da；Q3：194.1Da；时间：100ms；去簇电压：60V；碰撞电压：24V；碰撞室射出电压：15V；射入电压：10V。
[0033]本专利技术同时提供了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的使用方法，其采用上述肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的建立方法所建立的检测平台，包括以下步骤：
[0034]将睾酮在肝微粒体孵育体系中进行孵育得到孵育物；
[0035]取孵育物200μL，加入200μL含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡，离心，取上清100μL，转移至96孔板中，加入100μL超纯水，摇匀，LC
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MS/MS进样分析；其中甲醇沉淀剂卡马西平浓度为10ng/mL；
[0036]根据睾酮线性回归方程和6β
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羟基睾酮线性回归方程，计算孵育物中睾酮及其特异性产物6β
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羟基睾酮的浓度。
[0037]本专利技术的有益效果如下：
[0038]本专利技术建立的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台同时检测睾酮原型与代谢产物，针对一些需要同时检测分析的试验，缩短了分析时间，提高了检测效率。针对一些不必需同时检测分析的试验，相当于增加了联合检测，确保试验结果的准确性。
[0039]本专利技术建立的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台进行了系统的方法学验证，确保检测结果的准确性。
[0040]本专利技术建立的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台基质效应小、批内和批间准确度与精密度高、稳定性高，符合方法学验证要求，具有广泛的应用前景。
[0041]为让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
[0042]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0043]图1是本专利技术实施例中睾酮LC
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MS/MS中母离子和锥孔电压的优选结果；
[0044]图2是本专利技术实施例中6β
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羟基睾酮LC
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MS/MS中母离子和锥孔电压的优选结果。
具体实施方式
[0045]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0046]本实施例提供了一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的建立方法，本实施例中所述空白基质为包含人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液的肝微粒体孵育体系。本实施例甲醇沉淀剂中卡马西平浓度为10ng/mL，卡马西平即为本实施例的内标物。
[0047]本实施例肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的建立方法包括如下步骤：
[0048]步骤一、最优质谱条件的确定
[0049](1)建立包含人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液的肝微粒体孵育体系。
[0050](2)配置混合储备液
[0051]采用甲醇和睾酮标准品配置睾酮浓度为1mg/mL的睾酮储备液；
[0052]采用甲醇和6β
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羟基睾酮标准品配置6β
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、最优质谱条件的确定建立包含人肝微粒体、NADPH、氯化镁和PBS缓冲液的肝微粒体孵育体系；配置混合储备液，使所述混合储备液中睾酮和6β
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羟基睾酮的浓度相同；采用甲醇稀释混合储备液，得到睾酮系列浓度为5～5000ng/mL的标准曲线工作液，任意一个浓度的标准曲线工作液中睾酮和6β
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羟基睾酮的浓度相同；采用肝微粒体孵育体系稀释标准曲线工作液，得到睾酮系列浓度为0.5～500ng/mL的标准曲线样品；取100ng/mL的标准曲线样品，加入含卡马西平的甲醇沉淀剂，振荡、离心后，取上清加入超纯水，采用LC
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MS/MS进样分析；其中，对于睾酮分别设定第一质谱条件为：离子对m/z 289.4
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m/z 109.1，锥孔电压90V，碰撞电压40V；第二质谱条件为：离子对m/z 289.4
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m/z 97.1，锥孔电压90V，碰撞电压45V；第三质谱条件为：离子对m/z 289.4
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m/z 88.0，锥孔电压90V，碰撞电压55V；比较检测结果，得出睾酮最优质谱条件；其中，对于6β
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羟基睾酮分别设定第四质谱条件为：离子对m/z 305.1
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m/z 287.3，锥孔电压50V，碰撞电压20V；第五质谱条件为：离子对m/z 305.1
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m/z 269.3，锥孔电压50V，碰撞电压22V；第六质谱条件为：离子对m/z 305.1
→
m/z 227.2，锥孔电压50V，碰撞电压30V；比较检测结果，得出6β
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羟基睾酮最优质谱条件；步骤二、肝微粒体孵育体系中睾酮和6β
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羟基睾酮检测平台的建立设置睾酮最优质谱条件以及6β
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羟基睾酮最优质谱条件，将睾酮系列浓度为0.5～500ng/mL的标准曲线样品采用LC
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MS/MS进样分析，得到睾酮线性回归方程和6β
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羟基睾酮线性回归方程。2.根据权利要求1所述的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的建立方法，其特征在于，所述睾酮最优质谱条件为第一质谱条件。3.根据权利要求1所述的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的建立方法，其特征在于，所述6β
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羟基睾酮最优质谱条件为第五质谱条件。4.根据权利要求1所述的肝微粒体孵育体系中睾酮及6β
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羟基睾酮检测平台的建立方法，其特征在于，所述LC
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MS/MS分析中液相色谱条件为：流速：0.5mL/min；流动相A：含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱时长：...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，盘建红，
申请(专利权)人：安领生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：