一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法，所述基于纳米孔测序的病原分子检测方法包括：获取咽拭子样本或鼻咽拭子样本；对获取的咽拭子或鼻咽拭子样本进行核酸提取及纯化；cDNA的制备；cDNA的扩增及纯化；纳米孔文库的制备及测序；进行生物信息学分析，即可得病原分子检测结果。本发明专利技术能够基于临床样本直接进行病原分子检测，测序速度快，且能够进行实时监控；同时灵敏度高，检出限低。本发明专利技术的纳米孔文库构建逆转录时通用接头的添加和一步法PCR扩增，可实现临床样本中所有序列无偏差的扩增，不仅真实地反映了样本中的病原分子组成和丰度，更重要的是大大提高了检测的灵敏度和准确度。提高了检测的灵敏度和准确度。提高了检测的灵敏度和准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种基于纳米孔测序的病原分子检测方法。

技术介绍

[0002]目前：流感是一个主要的全球公共卫生威胁，因为它的高度致病性变体、大型人畜共患病库和大流行可能性。基因组学病毒测序为流感病毒的诊断试验提供了可能还提供了关于传播、进化和耐药性的见解，同时检测其他病毒。
[0003]现有大多数流感病毒的临床诊断试验依赖于病毒的检测呼吸道病毒核酸的抗原或PCR扩增；抗原测试通常快速，但敏感性较低；而PCR更耗时，但更敏感。但是不管测试结果如何，大多数临床诊断设备报告非定量(二进制)诊断结果，常规产生的用于流感诊断的数据能力提供流行病学联系、疫苗效力或抗病毒药物敏感性的见解有限。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的病原分子检测方法敏感性低、检测时间长，同时用于流感诊断的数据能力提供流行病学联系、疫苗效力或抗病毒药物敏感性的见解有限。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于纳米孔测序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
SuperScript IV Reverse Transcriptase(Thermo Fisher)逆转录酶在42℃下孵育10min，即获得样本中病原微生物的cDNA。6.如权利要求1所述基于纳米孔测序的病原分子检测方法，其特征在于，步骤三中，所述cDNA的扩增及纯化包括：(1)cDNA的扩增体系的配置：以上cDNA模板5μL，加入5μL AccuTaq LA(Sigma)reaction mixture，以及1μl引物B(5
’‑
GTTTCCCACTGGAGGATA
‑3’
)进行cDNA扩增；(2)PCR扩增条件：98℃30s，30个循环(94℃15s，50℃20s，68℃2min)，68℃10min；(3)扩增产物用AMPure XP磁珠(Beckman Coulter，Brea，CA)纯化，并使用Qubit高灵敏度双链DNA(dsDNA)试剂盒(Thermo Fisher)进行定量。7.如权利要求1所述基于纳米孔测序的病原分子检测方法，其特征在于，步骤四中，所述纳米孔测序文库的制备及测序包括：(1)通过NEBNext末端修复/dA尾添加模块进行修复和dA尾添加，并用AMPure XP磁珠纯化S
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dsDNA
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A，将不同样本中纯化的S
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dsDNA
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A连接相应的条形码后，再次用AMPure XP磁珠纯化，即可得纳米孔测序文库；(2)将利用制备好的纳米孔测序文库载入纳米孔测序芯片，通过MinION测序平台进行测序。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁丰华，张俊杰，万绍贵，林立安，陈小明，刘燕，
申请(专利权)人：赣南医学院，
类型：发明
国别省市：