一种基于鸡白痢沙门氏菌X蛋白包被的抗体ELISA检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于鸡白痢沙门氏菌X蛋白包被的抗体ELISA检测方法，涉及家禽细菌性疾病检测领域；本发明专利技术通过制备和纯化鸡白痢沙门氏菌的SPF鸡源高亲和力多克隆抗体，采用免疫共沉淀技术筛选鉴定电子传递链中的电子载体、兼具氧化还原酶活性的优势抗原X蛋白；构建、表达并以特定温和方法纯化外分泌的优势抗原X蛋白；建立检测鸡白痢沙门菌抗体的间接ELISA方法。本发明专利技术能有效检出鸡白痢沙门菌阳性抗体，并提高了现有检测技术的特异性、灵敏性；为企业鸡白痢沙门氏菌净化提供了有力工具。具。具。

【技术实现步骤摘要】
一种基于鸡白痢沙门氏菌X蛋白包被的抗体ELISA检测方法


[0001]本专利技术公开了一种基于鸡白痢沙门氏菌X蛋白包被的抗体ELISA检测方法，涉及家禽细菌性疾病检测领域。

技术介绍

[0002]鸡白痢(Pullorum disease，PD)是由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum，SP)引起的一种家禽传染病。SP主要侵害2
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3周龄的雏鸡，主要以白痢、败血症、心肌炎、脑炎为特征，会出现大批死亡。成年鸡感染后多呈慢性经过或隐性带毒，垂直传播使得后代雏鸡感染发病死亡。另外SP宿主细胞是免疫细胞
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巨噬细胞，感染后导致严重的免疫抑制，所以PD带来的直接死淘损失和间接经济损失都较为巨大。目前欧美发达国家已基本实现鸡白痢沙门氏菌的净化，然而在国内，鸡白痢沙门氏菌的感染广泛而严重，因此鸡白痢净化工作是各大养鸡公司的疾病防控重点。
[0003]目前鸡白痢净化策略主要是检测淘汰鸡白痢沙门菌的抗体阳性鸡，对于净化工作来说，最大的风险点莫过于“血清反应呈假阴性的阳性鸡”漏检后长期存在鸡群中。因此选择本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于鸡白痢沙门氏菌X蛋白包被的抗体ELISA检测方法，其特征在于，具体操作步骤如下：步骤(1)、通过制备和纯化鸡白痢沙门氏菌的SPF鸡源高亲和力多克隆抗体，采用免疫共沉淀方法筛选优势抗原X蛋白；步骤(2)、比对免疫共沉淀质谱得到的优势抗原X蛋白；步骤(3)、优势抗原X蛋白的构建、表达和纯化；步骤(4)、间接ELISA方法的建立。2.根据权利要求1所述的一种基于鸡白痢沙门氏菌X蛋白包被的抗体ELISA检测方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，通过采用免疫共沉淀方法筛选优势抗原X蛋白的具体操作步骤如下：(1.1)、阴性鸡血清制备：采集SPF鸡血清作为阴性鸡血清备用；(1.2)、阳性鸡血清制备：将LHSP001鸡白痢沙门氏菌进行复苏并扩培，口服感染SPF鸡，进行采血检测，收集薄板凝集抗体阳性鸡血清；并玻板凝集阳性血清；(1.3)、抗体纯化：将阴、阳性鸡血清采用饱和硫酸铵法进行纯化、透析脱盐，
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70℃保存备用；(1.4)、抗原复合物制备：将扩培的LHSP001鸡白痢沙门氏菌用1xPBS重悬洗涤后离心，按1g湿菌加4ml细菌裂解液进行温和裂解，4℃作用30min后，分别加入RNase A和DNase I；再4℃作用30min，最后加入PMSF，离心取上清，
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70℃保存备用；(1.5)、免疫共沉淀：(1.5.1)、取ProteinA/G 50ul加入EP管中，加500ul1XPBS洗涤，磁性分离，重复2次，先加入40ug/ml兔抗鸡抗体500ul，上下颠倒孵育30min后再加入纯化好的鸡IgG,4℃颠倒孵育8h；(1.5.2)、同步取ProteinA/G 50ul加入EP管中，加500ul1XPBS洗涤，磁性分离，重复2次，加入制备好的抗原复合物1ml，4℃颠倒孵育4h后，得到去除非特异性结合后的抗原复合物；(1.5.3)、对孵育好的样本进行磁性分离，加500ul1XPBS洗涤，重复2次，再加入去除非特异性结合后的抗原复合物，4℃颠倒孵育8h；(1.5.4)、磁性分离后，弃上清，加500ul1XPBS洗涤，磁性分离，重复2次，加入200ul 0.1Mglycine，PH2.5，孵育5
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7min，磁性分离收集上清；(1.5.5)、提取30ul跑蛋白电泳胶进行定性分析并记录；将剩余跑蛋白电泳胶进行质谱鉴定；(1.5.6)、对进行质谱鉴定的质谱结果梳理分析，并将免疫共沉淀得到的蛋白进行生物信息分析，最终筛选出优势抗原X蛋白。3.根据权利要求1所述的一种基于鸡白痢沙门氏菌X蛋白包被的抗体ELISA检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，比对免疫共沉淀质谱得到的优势抗原X蛋白的具体操作步骤如下：...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹丽萍，张凯云，杨铜，戎双琳，张瑶，牟抑扬，刘岳龙，张进，程立力，
申请(专利权)人：江苏兴牧农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：