一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法技术

本发明专利技术涉及一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法。其特征是：将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂对前处理后奶粉样品中的4种人乳寡糖进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标人乳寡糖的同时分析。同时根据4种衍生化人乳寡糖衍生物在本分析体系下所绘制的标准曲线，得到奶粉中目标人乳寡糖的绝对含量信息。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，时间短等特点，适用于奶粉和婴儿配方奶粉样品的快速、高通量分析。通量分析。通量分析。

【技术实现步骤摘要】
一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法


[0001]本专利技术涉及一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法。其特征是：将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标寡糖的同时分析。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，时间短等特点，适用于奶粉和婴儿配方奶粉样品的快速、高通量分析。
技术背景
[0002]母乳是婴儿喂养的黄金标准。然而，由于母亲身体等因素的影响，部分婴儿无法进行母乳喂养，只有采用第二种婴儿喂养方式，即配方奶粉喂养。在母乳和配方奶粉喂养的诸多不同之处中，有一点是关于胃肠道菌群发育:母乳喂养的婴儿肠道菌群中双歧杆菌和乳酸菌较为丰富。众所周知，这两种细菌对宿主的健康都有潜在的好处。低聚糖是人乳中的第三大成分，对婴儿的正常生长发育起着至关重要的作用，如抗炎、抗感染、免疫调控和维持肠道菌群平衡，而低聚糖的缺乏很可能是造成这一差异的原因。
[0003]为了缩小这种差别，通常在配方奶粉中添加GOS和FOS，然而二者与天然存在的人乳寡糖结构差距较大，在过去一年左右的时间里，出现了一种新的以牛乳为基础的儿科配方，这些配方中添加与人乳中相同的低聚糖，如2
’
FL和LNnT，以帮助进一步缩小这一差距。除了解决这一差异的需求外，还需要更好地认识目前市售的婴儿配方奶粉中存在的主要的低聚糖浓度(3
’
SL和6
’
SL含量最高)，作为新配方的基础。因此，含有人乳寡糖的配方奶粉的开发和相应的质量控制要求合适的方法来准确测定人乳寡糖的含量。
[0004]我们发展一种简单、快速、高通量的法实现奶粉中的2'FL、LNnT、3
’
SL和6
’
SL的同时定量。由于奶粉中自身存在的3
’
SL和6
’
SL含量较低，因此我们采用荧光检测器分析酸性寡糖：3
’
SL和6
’
SL，紫外检测器分析中性寡糖：2'FL和LNnT，兼顾了人乳寡糖由于含量差异而难以同时定量的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术涉及一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法。本专利技术特征在于：将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标人乳寡糖的同时分析。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种基于衍生化的奶粉中目标寡糖的定量方法，将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标寡糖的同时分析，获得奶粉中目标人乳寡糖的含量信息。流动相为有机溶剂和水或有机溶剂和缓冲盐水溶液，通过优化色谱参数，使用等度或梯度洗脱条件。
[0008]1.所述前处理步骤为：取一定奶粉样品，加水和有机溶剂按一定比例溶解后配成1-2000mg/mL的样品溶液，加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃500-50000g离心不少于5分钟，取出上层清液，按照奶粉质量的1％-100％加入吸附材
料进一步除去剩余蛋白以及其他低极性物质，涡旋震荡不少于5秒，然后0-10℃500-50000g离心不少于5分钟，收集上清液，离心1-5次后蒸干，得到奶粉中寡糖除蛋白样品；
[0009]2.衍生化包括：将前处理后的奶粉样品中加入衍生化试剂、氰基硼氢化钠、DMSO和冰醋酸溶液，在25-100℃的条件下反应15min-5h，反应结束后，于-10-10℃放置0.5-60分钟终止反应；
[0010]衍生化试剂为邻氨基苯甲酰胺，邻氨基苯甲酸，2-氨基吖啶酮等；
[0011]3.所述分析方法所采用的色谱柱固定相均为极性色谱填料，包括硅胶或极性键合硅胶填料，其结构式如下：
[0012][0013]其中SiO2为硅胶，R为极性基团，有氨基酸、酰胺、氨基、羧基、糖基和两性离子等中的一种或几种；
[0014]4.所述流动相中的有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种；
[0015]5.所述缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及pH如下：
[0016]a)甲酸铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH 2.0-7.0；
[0017]b)乙酸铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH 2.0-7.0；
[0018]c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH 6.0-9.0；
[0019]6.优化流动相梯度如下：流动相水或者缓冲盐水溶液和有机溶剂作为洗脱液，混合比例为5/95～95/5；
[0020]7.优化色谱操作参数如下：色谱柱内径2.1-10mm；流速为0.1-2BV/min；柱温为15-60℃；检测器：荧光检测器、紫外检测器和质谱检测器；
[0021]本专利技术具有如下优点：
[0022]1.选择性高。本专利技术提出使用极性色谱填料作为固定相，4种目标寡糖可以获得较好的分离，有效的解决了离子交换色谱或凝胶过滤色谱选择性不足的问题。
[0023]2.优化前处理方法，减小了奶粉中杂质的污染和干扰。
[0024]3.衍生化反应提高检测灵敏度，与此同时，衍生化试剂死时间流出，不干扰目标寡糖的定量。
[0025]4.采用紫外检测器和荧光检测器进行检测，缩短了检测时间，同时兼顾了奶粉中添加高含量寡糖(2
’
FL、LNnT)和内源性低含量寡糖(3
’
SL、6
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SL)的同时定量分析。
[0026]5.重复性好。本专利技术中使用的色谱柱固定相具有很好的稳定性，易实现自动化。
[0027]6.适用范围广，可用于不同奶粉及婴儿配方奶粉的分析。
[0028]7.该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，时间短等特点，适用于奶粉和婴儿配方奶粉样品的快速、高通量分析。
附图说明
[0029]图1为实施例1、2和3中衍生化试剂的结构。
[0030]图2为实施例1衍生化后寡糖标准品混合物在荧光检测器及紫外检测器下的色谱图。
[0031]图3为实施例1中洗脱过程阀切换状态图。
具体实施方式
[0032]实施例1：
[0033](1)奶粉样品的前处理
[0034]取牛奶粉样品50mg(其中含有自添加寡糖2
’
FL：1.5mg；LNnT：0.75mg)，加入0.5mL水溶解配成100mg/mL的样品溶液，加入样品溶液1倍体积量的无水乙醇混匀，于4℃静置2小时后，4℃40000g离心10分钟，取出上层清液，加入C
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吸附材料20mg进一步除去剩余蛋白以及其他低极性物质，涡旋震荡30秒，然后4℃40000g离心10分钟，收集上清液，离心1次后蒸干，得到牛奶粉中寡糖除蛋白样品；
[0035](2)奶粉中寡糖除蛋白样品的衍生化
[0036]将前处理后的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖的定量方法，其特征在于，具体的步骤如下：(1)将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂对前处理后奶粉样品中的4种人乳寡糖进行衍生化；(2)采用亲水作用色谱(HILIC)对步骤(1)中衍生化的人乳寡糖进行分离分析，记录色谱图和峰面积；(3)将4种人乳寡糖标准品分别取3个以上不同质量依次进行步骤(1)中的衍生化和步骤(2)的分离分析，记录色谱图和峰面积，以峰面积Y对质量X(mg)进行线性回归计算，得衍生化人乳寡糖的线性回归方程或标准曲线，将步骤(2)得到的4种人乳寡糖峰面积分别代入它们对应的线性回归方程或标准曲线，得到奶粉样品中目标人乳寡糖的绝对含量信息；4种人乳寡糖包括：2
’
FL(2
’-
Fucosyllactose)：Fucα1-2Galβ1-4GlcLNnT(Lacto-N-Neotetraose)：Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc3
’
SL(3
’-
Sialyllactose)：Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc6
’
SL(6
’-
Sialyllactose)：Neu5Acα2-6Galβ1-4Glc。2.按照权利要求1所述的定量方法，其特征在于，4种人乳寡糖包括：2
’
FL(2
’-
Fucosyllactose)：Fucα1-2Galβ1-4GlcLNnT(Lacto-N-Neotetraose)：Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc3
’
SL(3
’-
Sialyllactose)：Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc6
’
SL(6
’-
Sialyllactose)：Neu5Acα2-6Galβ1-4Glc以峰面积Y对质量X(mg)进行线性回归计算，2
’
FL的线性回归方程为:Y＝70000X+52200,R2＝0.9991；LNnT的线性回归方程为:Y＝30000X-1821.8,R2＝0.9999；3
’
SL的线性回归方程为:Y＝29524X+884.67,R2＝0.9997，6
’
SL的线性回归方程为:Y＝29742X+706.18,R2＝0.9998。3.按照权利要求书1所述的定量方法，其特征在于，步骤(1)所述的前处理步骤为：取奶粉，加水和/或有机溶剂溶解后配成1-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，李欣，闫竞宇，李佳齐，郭志谋，叶贤龙，金高娃，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：