LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法技术

本发明专利技术属于食品检测技术领域，具体涉及一种LC‑MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法，以特定的猪肉特征多肽作为检测的分析对象，以同位素标记的所述特征多肽为内标物，采用内标标准曲线法定量。本发明专利技术基于高效液相色谱‑串联质谱技术，结合筛选出可用于准确定量分析的猪肉多肽，制备相应的同位素内标多肽，建立了测定肉制品中猪肉含量的内标定量方法。该方法通过绘制内标法猪肉标准曲线，可准确计算其中所含有的猪肉含量，是一种灵敏、稳定、特异、高通量、操作性强、定量准确的分析方法。

【技术实现步骤摘要】
LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法。
技术介绍
肉制品是我国居民饮食结构中的重要组成部分，深受消费者的喜爱。由于我国居民消费以猪肉为主，当前国内猪肉制品所占的市场份额最大，占比超60％。近几年，受非洲猪瘟疫情的影响，生猪跨省调运，生猪交易市场被关闭，猪肉价格显著增长，进而导致猪肉制品生产企业成本明显增高。一些不法商家为了降低成本，使用大量植物蛋白替代畜禽肉成分，或者用鸡、鸭肉(低价肉)替代或部分替代猪肉，但在配料表中却不按事实标注，虽然蛋白总量符合要求，但动物蛋白较低，使得产品价格低于市场价格，致合规性肉类制品企业的产品在市场上受阻，竞争力不足，长此以往影响企业的生存及发展。因此建立肉制品中猪肉含量的测定方法既顺应市场需求，也可为规范行业标识、维护市场公平提供强有力的技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法。本专利技术选择定量较好的猪肉多肽作为分析对象，通过前处理方法提取待测肉制品中猪肉特异性多肽，并加入合成的同位素内标多肽，用于校正仪器状态、基质效应以及实验前处理过程中的损失，然后进行LC-MS/MS分析，并建立猪肉对应多肽及内标的标准曲线，以猪肉含量作为横坐标，定量多肽与对应内标多肽的峰面积比值作为纵坐标，通过内标法计算得到待测肉制品中猪肉含量。具体来说，本专利技术提供了如下技术方案：一种LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法，包括以下步骤：对含猪肉的待测肉制品进行预处理，得到待测肉制品的多肽样品溶液；采用液相色谱串联质谱对所述多肽样品溶液进行检测，以猪肉的特征多肽作为检测的分析对象，以同位素标记的所述特征多肽为内标物，采用内标法对待测肉制品中猪肉的含量进行定量检测；其中，所述特征多肽选自Pep_1至Pep_3中的一种或两种以上：Pep_1的序列如下:EPITVSSDQMAK(SEQIDNo.1)；Pep_1的序列如下:GGPLTAAYR(SEQIDNo.2)；Pep_1的序列如下:HDPSLLPWTASYDPGSAK(SEQIDNo.3)本专利技术的专利技术人利用高分辨质谱对纯猪肉及猪肉制品进行数据采集，并使用蛋白质组学数据库和软件进行数据分析，筛选出猪肉的专属性多肽链；将得到的多肽链信息转化为离子对信息导入至LC-MS/MS，通过优化仪器条件，对样品信息进行数据采集及处理，筛选响应值高、稳定性好、定量准确的多肽链及离子信息；制备同位素内标多肽，通过标准曲线数据拟合及样品分析，进一步筛选出如上表所示的使用内标法定量的多肽信息。图1为猪肉的总离子流图和3种特征多肽的提取离子流图。优选的，上述LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法中，所述同位素标记的特征多肽的信息如如ISTD_1至ISTD_3所示，其中，所述ISTD_1为同位素标记Pep_1后的多肽，所述ISTD_2为同位素标记Pep_2后的多肽，所述ISTD_3为同位素标记Pep_3后的多肽：优选的，上述LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法中，所述特征多肽为Pep_2。优选的，上述LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法中，所述内标法的步骤包括：配制含不同浓度梯度标准猪肉多肽样品与相同浓度内标物的混合标准品工作溶液，以标准猪肉多肽样品对应的猪肉质量浓度为横坐标，以特征多肽与内标物的色谱峰面积比为纵坐标，建立标准曲线；对加入有相同浓度内标物的待测肉制品的多肽样品溶液进行检测，根据所述标准曲线计算待测肉制品中猪肉的含量。优选的，上述LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法中，所述预处理包括以下步骤：(1)提取样品高丰度蛋白：向待测肉制品中加入提取液，在液氮条件下进行冷冻研磨，然后离心取上清液；(2)向步骤(1)取得的上清液中加入NH4HCO3和胰蛋白酶进行酶解，加入三氟乙酸终止反应，经过HLB固相萃取柱净化，供上机检测。优选的，上述LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法中，所述提取液为0.04～0.06mol/LTris-HCl、6～8mol/L尿素、1～3mol/L硫脲。本专利技术基于高效液相色谱-串联质谱技术，结合筛选出的可用于准确定量分析的猪肉特征多肽，制备相应的同位素内标多肽，建立了测定肉制品中猪肉含量的内标定量方法。该方法通过绘制内标法猪肉标准曲线，可准确计算其中所含有的猪肉含量，是一种灵敏、稳定、特异、高通量、操作性强、定量准确的分析方法。附图说明图1为猪肉的总离子流图和3种特征多肽的提取离子流图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的实验原料和相关设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1实施例1提供一种LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法，以猪肉的特征多肽作为检测的分析对象，以同位素标记的所述特征多肽为内标物，采用内标标准曲线法定量。所述特征多肽和同位素内标多肽的信息如表1所示。表1定量多肽离子信息1、样品前处理将5组模拟肉丸(成分含量见表2)作为待测肉制品，用制样机研磨均匀，称取0.5g，加入5mL提取液，液氮冷冻研磨30s，15000r/min离心10min，取300μL上清液，加入30μL内标物溶液(200μg/mL)，加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL，56℃振荡反应1h，放置室温，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20μL，暗处反应30min，再加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液15μL，暗处反应15min；加入25mmol/LTris-HCl缓冲溶液750μL，然后加入20μg胰蛋白酶，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入0.4％TFA终止反应，并加入1mL水，全部过HLB固相萃取柱(乙腈、0.1％乙酸水活化，上样)，1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱并过0.22μm滤膜，即得添加内标物的待测肉制品的多肽样品溶液，准备上机。表25组模拟肉丸的成分含量2、猪肉标准曲线的建立取猪肉(冷冻猪肉，需化冻)称取0.5g，加入5mL提取液，液氮冷冻研磨30s，15000r/min离心10min，分别取上清液20μL、50μL、100μL、200μL、300μL至5个管并加入适量的提取液分别定容为300μL，后续处理步骤同步骤1，即得含不同浓度梯度标准猪肉多肽样品与相同浓度内标物的混合标准品工作溶液。采用液相色谱串联质谱检测上述混合标准品工作溶液，以标准猪肉多肽样品对应的猪肉质量浓度为横坐标，以猪肉多肽峰面积/内标多肽峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。其中，以所述取上清液20μL最终得到的标准猪肉多肽样品为例，其对应的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：对含猪肉的待测肉制品进行预处理，得到待测肉制品的多肽样品溶液；采用液相色谱串联质谱对所述多肽样品溶液进行检测，以猪肉的特征多肽作为检测的分析对象，以同位素标记的所述特征多肽为内标物，采用内标法对待测肉制品中猪肉的含量进行定量检测；/n其中，所述特征多肽选自Pep_1至Pep_3中的一种或两种以上：/n

【技术特征摘要】
20201022 CN 20201114161431.一种LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：对含猪肉的待测肉制品进行预处理，得到待测肉制品的多肽样品溶液；采用液相色谱串联质谱对所述多肽样品溶液进行检测，以猪肉的特征多肽作为检测的分析对象，以同位素标记的所述特征多肽为内标物，采用内标法对待测肉制品中猪肉的含量进行定量检测；
其中，所述特征多肽选自Pep_1至Pep_3中的一种或两种以上：





2.根据权利要求1所述的LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法，其特征在于，所述同位素标记的特征多肽的信息如ISTD_1至ISTD_3所示，其中，所述ISTD_1为同位素标记Pep_1后的多肽，所述ISTD_2为同位素标记Pep_2后的多肽，所述ISTD_3为同位素标记Pep_3后的多肽：








3.根据权利要求1或2所述的LC-MS/MS内标法测定肉制品中猪肉含量的方法，其特征在于，所述特征多肽为Pep_2。

【专利技术属性】
技术研发人员：李莹莹，张颖颖，王守伟，张明悦，康超娣，郭文萍，赵文涛，李慧晨，
申请(专利权)人：北京食品科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11