一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法技术

本发明专利技术提供了一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的固体核磁共振方法，属于生物物理和生物化学技术领域，包括：对膜融合蛋白进行

【技术实现步骤摘要】
一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法
本专利技术属于生物物理和生物化学
，尤其涉及一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法。
技术介绍
细胞膜融合是生物体常见的生理现象，广泛存在于各种生命系统中。通过细胞膜融合，两套独立的双层脂分子合二为一，完成一定的生物功能。例如：成肌细胞的融合产生骨骼肌、破骨细胞的融合产生骨以及滋养细胞的融合产生胎盘；在先天免疫应答中，巨噬细胞融合形成多核巨细胞，吞噬并摧毁病原体。异常的细胞膜融合则与人类的疾病密切相关。膜融合通常不会自发发生，需要在膜融合蛋白的诱导下实现细胞膜的融合，有些膜融合过程通过同一蛋白完成，如：病毒侵染时的融合1，而某些膜融合过程则需要多个蛋白形成复合物驱动，如：SNARE复合物驱动的膜融合2,3等。因此，探索不同膜融合蛋白的机理和融合反应的分子机制，有助于对生命现象本质的深入了解。膜融合的机理非常复杂，为了描述这一过程，需要对膜融合蛋白的结构、蛋白与膜间的相互作用、以及膜融合蛋白在细胞膜上的拓扑结构进行详细的表征。研究蛋白结构的技术主要包含X-ray晶体衍射技术、冷冻电镜技术、液体核磁共振技术和固体核磁共振技术四种。在膜融合蛋白-脂质体复合物中，由于脂质体的存在，限制了X-ray晶体衍射技术和冷冻电镜技术的应用；由于脂质体体积较大，液体核磁共振技术则受到了分辨率的限制。固体核磁共振技术可以研究多种形态的样品，广泛地应用于膜蛋白的结构解析，因此适用于融合反应后膜融合蛋白-脂质体复合物中的蛋白的结构研究。然而在膜融合蛋白的拓扑结构鉴定方面，即分析膜融合蛋白在细胞膜中的定位方面，依然存在着技术挑战。首先，由于膜融合体系的不均匀性，对样品体系有序性要求很高的OrientSampleNMR(OS-NMR)技术不适用；其次，基于固体NMR的H/D交换实验可以获取膜蛋白与顺磁性分子或水分子的相互作用，间接获取拓扑结构，但不适合鉴定细胞膜与蛋白的相互作用。因此，需要发展一种新方法用于膜融合体系中膜融合蛋白的定位。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，采用本专利技术提供的核磁共振方法能够检测膜融合蛋白在脂质体中的定位。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，包括以下步骤：1)对膜融合蛋白进行15N标记，得到标记蛋白，将所述标记蛋白与不同类型脂质体反应，得到蛋白-脂质体复合物；2)对所述步骤1)得到的蛋白-脂质体复合物进行固体核磁共振，采集一维1H-15N固体核磁图谱。其中包括与一定比例的络合镧系金属离子的顺磁磷脂分子的顺磁脂质体，和不含有顺磁磷脂分子的非顺磁脂质体。根据一维1H-15N固体核磁图谱在不同类型脂质体中的对比，分析膜融合蛋白在脂质体中的定位；所述固体核磁共振的条件包括：1H的π/2脉冲时间设为2.6μs，1H-15N极化接触时间为0.5ms，15N的连续锁场功率为70kHz，1H的锁场功率为80kHz，采样数为2048，记录15N化学位移，采用SPINAL序列对1H去耦，去耦功率为100kHz，循环等待时间为2s。优选的，利用600MHzBrukerAvanceIII固体核磁共振仪进行固体核磁共振，魔角转速设置为10kHz。优选的，所述膜融合蛋白包括PSI蛋白。优选的，所述步骤1)脂质体中含有磷脂和顺磁磷脂。优选的，所述脂质体中磷脂的质量百分含量为50-100％。优选的，所述脂质体中顺磁磷脂的质量百分含量为0.5-10％。优选的，所述顺磁磷脂包括结合Gd3+，Cu2+，Tm3+，Tb3+，Dy3+，Mn2+，Fe3+，Co2+等金属离子的磷脂，本案例中用的为Gd3+-DMPE-DTPA。优选的，所述步骤1)标记蛋白与脂质体的摩尔质量比为1:5～35。优选的，所述步骤1)反应的条件包括：所述反应的时间为8～60min，所述反应的温度为4～37℃。优选的，所述步骤1)膜融合蛋白的纯度在90％以上。本专利技术提供了一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，包括以下步骤：1)对膜融合蛋白进行15N标记，得到标记蛋白，将所述标记蛋白与脂质体反应，得到蛋白-脂质体复合物；2)对所述步骤1)得到的蛋白-脂质体复合物进行固体核磁共振，采集一维1H-15N固体核磁图谱，根据一维1H-15N固体核磁图谱，分析膜融合蛋白在脂质体中的定位；所述固体核磁共振的条件包括：1H的π/2脉冲时间设为2.6μs，1H-15N极化接触时间为0.5ms，15N的连续锁场功率为70kHz，1H的锁场功率为80kHz，采样数为2048，记录15N化学位移，采用SPINAL序列对1H去耦，去耦功率为100kHz，循环等待时间为2s。本专利技术解决了在膜融合体系中，膜融合蛋白在脂质体中的拓扑定位的问题。利用顺磁磷脂在脂质体的表面修饰了顺磁离子，如果膜融合蛋白位于脂质体表面，则距离顺磁中心较近，受到的弛豫增强效应导致谱线变宽信号减弱，因此可以通过对比顺磁和非顺磁脂质体上蛋白质信号的变化，判断膜融合蛋白的膜表面定位。如果蛋白位于脂质体内部，核磁共振信号顺磁和非顺磁脂质体上信号强度差异较小，可以用于判断插入细胞膜模式的定位。附图说明图1未利用顺磁磷脂检测蛋白定位结果，其中A，原理图示意图，a，顺磁磷脂Gd3+-DMPE-DTPA的分子结构；b，加入顺磁磷脂后形成的脂质体示意图，G表示顺磁中心，红色表示蛋白；B，通过顺磁磷脂鉴定PSI在不同脂质体中的拓扑结构；(a-c)为PS-free脂质体中顺磁磷脂含量分别为0，1.5％和3％时PSI的一维15NNMR谱图；(d-f)为PS-contained脂质体中顺磁磷脂含量分别为0，1.5％和3％时PSI的一维15NNMR谱图；g为PS-free脂质体(红)和PS-contained脂质体(黑)中PSI信号的相对强度随顺磁磷脂含量的变化曲线。具体实施方式本专利技术提供了一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，包括以下步骤：1)对膜融合蛋白进行15N标记，得到标记蛋白，将所述标记蛋白与脂质体反应，得到蛋白-脂质体复合物；2)对所述步骤1)得到的蛋白-脂质体复合物进行固体核磁共振，采集一维1H-15N固体核磁图谱，根据一维1H-15N固体核磁图谱的对比，分析膜融合蛋白在脂质体中的定位；所述固体核磁共振的条件包括：1H的π/2脉冲时间设为2.65μs，1H-15N极化接触时间为0.5ms，15N的连续锁场功率为70kHz，1H的锁场功率为80kHz，采样数为2048，记录15N化学位移，采用TPPM序列对1H去耦，去耦功率为10kHz，循环等待时间为2s。本专利技术对膜融合蛋白进行15N标记，得到标记蛋白，将所述标记蛋白与脂质体反应，得到蛋白-脂质体复合物。在本专利技术中，所述膜融合蛋白包括PSI蛋白。在本专利技术中，所述PSI蛋白是位于植物天冬氨酸蛋白酶上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)对膜融合蛋白进行

【技术特征摘要】
1.一种检测膜融合蛋白在脂质体中定位的核磁共振方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对膜融合蛋白进行15N标记，得到标记蛋白，将所述标记蛋白与脂质体反应，得到蛋白-脂质体复合物；
2)对所述步骤1)得到的蛋白-脂质体复合物进行固体核磁共振，采集一维1H-15N固体核磁图谱，根据一维1H-15N固体核磁图谱，分析膜融合蛋白在脂质体中的定位。


2.根据权利要求1所述的核磁共振方法，其特征在于，利用600MHzBrukerAvanceIII固体核磁共振仪进行固体核磁共振，魔角转速设置为10kHz。


3.根据权利要求1所述的核磁共振方法，其特征在于，所述膜融合蛋白包括PSI蛋白。


4.根据权利要求1所述的核磁共振方法，其特征在于，所述步骤1)脂质体中含有磷脂和顺磁磷脂。


5.根据权利要求4所述的核磁共振方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王申林，赵晓丽，钱朝晖，欧秀元，邹梦冰，马常兴，
申请(专利权)人：北京大学，中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11