一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法，具体为取待观测皮革样品冷冻切片，切片置于高锰酸钾中氧化处理，经水洗、漂白、水洗、醇洗、染色、醇洗、水洗、无水乙醇脱水处理的步骤，然后置于二甲苯溶液中透明处理，处理后置于超景深显微镜载物台上，调整细（粗）准焦螺旋来确定合适的拍摄起始位置，拍照结束后沿Z轴对所有的照片进行叠加处理后即可获得观测结果。染色液配制方法为将碱性品红溶于乙醇中，再加三聚乙醛和浓盐酸，混合后于室温放置2‑3天得染色液。本发明专利技术基于超景深显微镜具有视野范围广、成像全面、图像清晰，分辨率高，聚焦快，可以实现3D立体成像的优点，实现了对皮革中弹性纤维状态变化的清晰准确的动态观测效果。

【技术实现步骤摘要】
一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法
本专利技术属于皮革纤维检测
，具体涉及一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法。
技术介绍
动物皮的真皮层中含有丰富的蛋白纤维，如胶原纤维，弹性纤维，网状纤维等。其中，弹性纤维是动物皮真皮层中重要的结构蛋白，对于维持动物皮的物理机械性能和弹性具有重要意义。在制革加工中，真皮层中弹性纤维的存在状态和被破坏程度对成革的柔软度有较大影响。研究表明蓝湿革软化过程中酸性蛋白酶的作用机理是通过酶对蓝湿革内的弹性蛋白的破坏，降低了其对胶原纤维的束缚，从而使胶原纤维得到分散，对皮革产生软化效果。因此有必要对制革加工过程中弹性纤维的存在状态和受破坏程度进行观察。弹性纤维由疏水氨基酸含量高的弹性蛋白和微原纤维构成，其折光性强，HE染色不易着色，另外纤维较细（直径约0.2～1.0μm），因此观测难度相对较大。传统的组织学观察弹性纤维的方法是用染色液对弹性纤维进行特异性染色后，采用普通光学显微镜来观察。然而常规的弹性纤维观测方法有一定的局限性，如：1）光学显微镜成像分辨率低，视野范围窄；2）由于弹性纤维在生皮中形成立体网络结构，采用光镜无法观测到弹性纤维的整体结构，且对于平整度不足的样品切片，无法清晰成像；3）因光镜的聚焦原因，无法观测到弹性纤维的动态变化过程；4）对于蓝湿革等有颜色干扰的样品有一定的观测困难。超景深显微镜是一种具有景深合成功能的显微镜，通过对显微镜头连续变焦时采集的非平面物体的图像进行聚焦分析、图像融合，形成一幅新的各区域都清晰的全景深的图像，解决了光学显微镜在放大倍数，分辨率，景深，视野范围方面的几个矛盾，成为立体三维观察的重要工具。超景深显微镜广泛应用于微生物观察，半导体质量监控，精密仪器加工等方面。近年来逐渐有人将景深显微镜应用于皮革样品的观察。如：四川省皮革研究所陈磊等人（中国皮革，2016,11,1-4+11）采用超景深显微镜观察样品的粒面和截面,通过分析比较样品粒面和截面的特征来鉴别天然皮革和人工革。广州市质量监督检测研究院的李珊珊等人（西部皮革,2013,16,16-21）运用超景深三维显微镜观察并对比了普通的、仿鹿的、仿绵羊的、贴膜的、缩纹的、反绒面的山羊皮革以及鹿皮革、绵羊皮革的粒面与截面的表观形态特征,总结了它们的形态特征规律,可用于特殊风格山羊皮革的材质定性鉴别。广州检验检测认证集团有限公司的陈宗良等人（CN108254375A）用超景深显微镜观察并计算皮革粒面毛孔所占比例来区分鉴别黄牛皮革和水牛皮革。还有广州市质量监督检测研究院的孙世彧等人（CN102809563A）用超景深显微镜简易的观察了皮革截面的纤维结构，该方法主要用于观察皮革胶原纤维的结构，无法精确的区分皮革中的胶原纤维，弹性纤维，进而无法准确的观察制革过程中弹性纤维的动态变化。综上所述，研发一种能够观察制革过程中弹性纤维的动态变化的方法具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中观察皮革纤维结构效率低、成像范围窄、分辨率不足、成像效果差、及无法观测制革过程中弹性纤维的动态变化的问题，本专利技术提供了一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法，将皮革中的弹性纤维进行特异性染色后，采用超景深显微镜实现快速聚焦，获得高质量观测数据。本专利技术通过以下技术方案实现：一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法，包括以下步骤：（1）冷冻切片：取待观测皮革样品在冷台上冷冻处理2~4h，冷冻结束后对样品进行切片，备用；（2）染色：将步骤（1）中的切片置于0.4-0.6%高锰酸钾氧化液中处理5~20min，水洗3~5次，置于1.5-3%的草酸溶液中漂白2~10min，水洗3~5次，醇洗3~5次，然后置于含有染色液中染色5~30min，醇洗染色后的切片至无紫色染液脱出，水洗切片3~5次，使用无水乙醇做脱水处理，最后将切片置于二甲苯溶液中透明处理5-15min，吸取切片表面残留的二甲苯溶液至无明显液体渗出；（3）观察：将步骤（2）染色结束后的切片置于超景深显微镜载物台上，调整细（粗）准焦螺旋来确定合适的拍摄起始位置，拍照结束后沿Z轴对所有的照片进行叠加处理后即可获得观测结果；步骤（2）中所述的染色液配制方法为：将碱性品红溶于乙醇中，再加三聚乙醛和浓盐酸，混合后于室温放置2-3天得染色液。进一步地，所述染色液中碱性品红的浓度为0.01g/mL；所述乙醛的加入量为染色液体积的1%；所述的浓盐酸的加入量为染色液体积的1%。进一步地，所述的乙醇为质量浓度70%的乙醇溶液；所述的浓盐酸浓度为12mol/L。进一步地，步骤（1）中所述的冷冻处理温度为-20℃，待观测皮革的切片厚度为5~25μm。进一步地，步骤（2）染色中醇洗使用的溶剂为70%乙醇溶液。进一步地，步骤（3）中超景深显微镜放大倍数为1000倍。本专利技术方法一方面基于改良的弹性纤维染色方法，首先对皮革中的弹性纤维进行特异性的染色处理，来提高皮革中纤维组分的区分度。另一方面基于超景深显微镜具有视野范围广、成像全面、图像清晰，分辨率高，聚焦快，可以实现3D立体成像的优点，实现了对弹性纤维清晰准确的观测效果。因此，利用该方法可以准确的从皮革中多种纤维成分里区分弹性纤维组分，同时对其状态进行精确观测，对于研究制革中弹性纤维的动态变化具有重要帮助。有益效果（1）本专利技术基于超景深显微镜具有视野范围广、成像全面、图像清晰，分辨率高，聚焦快，可以实现3D立体成像的优点，实现了对弹性纤维清晰准确的观测效果；（2）本专利技术方法可以准确的从皮革中多种纤维成分里区分弹性纤维组分，同时对其状态进行精确观测，对于研究制革中弹性纤维的动态变化具有重要帮助。附图说明图1为实施例1未经酸性蛋白酶处理的弹性纤维超景深显微镜照片；图2为实施例2未经酸性蛋白酶处理的弹性纤维超景深显微镜照片；图3为实施例3蓝湿革（酸性蛋白酶软化后）弹性纤维超景深显微镜照片；图4为实施例4蓝湿革（酸性蛋白酶软化后）弹性纤维超景深显微镜照片；图5为实施例5浸酸后生皮弹性纤维超景深显微镜照片。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是进一步说明本专利技术的特征及优点，而不是对本专利技术进行限制。实施例1（1）冷冻切片：蓝湿革回水处理后，沿背脊线相邻部位取尺寸为15mm×5mm的样品，粒面向上置于冷冻切片机的冷台上，冷冻处理2h（冷台温度为-20℃），冷冻结束后对样品进行切片（切片厚度为20μm），将切片置于载玻片上，备用；（2）染色，具体染色步骤如下：氧化：将切片置于0.5%高锰酸钾氧化液中处理10min；水洗：使用滴管吸取蒸馏水稍洗氧化后的切片3次；漂白：将稍洗后的切片置于2%草酸溶液中漂白10min；冲洗：使用滴管吸取蒸馏水冲洗漂白后的切片3次；乙醇冲洗：使用滴管吸取70%乙醇稍洗3次；染色：将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）冷冻切片：取待观测皮革样品在冷台上冷冻处理2~4 h，冷冻结束后对样品进行切片，备用；/n（2）染色：将步骤（1）中的切片置于0.4-0.6%高锰酸钾氧化液中处理5~20min，水洗3~5次，置于1.5-3%的草酸溶液中漂白2~10min，水洗3~5次，醇洗3~5次，然后置于含有染色液中染色5~30 min，醇洗染色后的切片至无紫色染液脱出，水洗切片3~5次，使用无水乙醇做脱水处理，最后将切片置于二甲苯溶液中透明处理5-15min，吸取切片表面残留的二甲苯溶液至无明显液体渗出；/n（3）观察：将步骤（2）染色结束后的切片置于超景深显微镜载物台上，调整细（粗）准焦螺旋来确定合适的拍摄起始位置，拍照结束后沿Z轴对所有的照片进行叠加处理后即可获得观测结果；/n步骤（2）中所述的染色液配制方法为：将碱性品红溶于乙醇中，再加三聚乙醛和浓盐酸，混合后于室温放置2-3天得染色液。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用超景深显微镜观察皮革中弹性纤维的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）冷冻切片：取待观测皮革样品在冷台上冷冻处理2~4h，冷冻结束后对样品进行切片，备用；
（2）染色：将步骤（1）中的切片置于0.4-0.6%高锰酸钾氧化液中处理5~20min，水洗3~5次，置于1.5-3%的草酸溶液中漂白2~10min，水洗3~5次，醇洗3~5次，然后置于含有染色液中染色5~30min，醇洗染色后的切片至无紫色染液脱出，水洗切片3~5次，使用无水乙醇做脱水处理，最后将切片置于二甲苯溶液中透明处理5-15min，吸取切片表面残留的二甲苯溶液至无明显液体渗出；
（3）观察：将步骤（2）染色结束后的切片置于超景深显微镜载物台上，调整细（粗）准焦螺旋来确定合适的拍摄起始位置，拍照结束后沿Z轴对所有的照片进行叠加处理后即可获得观测结果；
步骤（2）中所述的染色液配制方法为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彦春，祝德义，李昊，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37