在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9‑NRCH突变体及其应用。本发明专利技术在水稻基因打靶实验过程中，意外获得了一种新的SpCas9‑NRCH突变体，发现利用该SpCas9‑NRCH基因进行水稻剪切，能够识别特异位点。并且本发明专利技术提供一种基于该基因构建的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明专利技术利用所获得的SpCas9‑NRCH构建植物表达载体，构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切，实现了水稻基因打靶，并且以高突变效率获得转基因水稻植株。

【技术实现步骤摘要】
在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体及其应用
本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
具体而言，本专利技术涉及一种在基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体及其在水稻基因打靶方面的应用。
技术介绍
CRISPR/Cas基因编辑系统已成为植物功能基因研究和分子育种的重要手段。CRISPR/Cas在进行基因编辑过程中除了需要单链引导RNA(singleguideRNA,sgRNA)与基因组上的靶序列碱基互补配对外，还需要基因组上的靶序列附近必须存在几个称之为前间区序列邻近基序(Protospacerasjacentmotif,PAM)特异碱基。传统的CRISPR/Cas系统多使用Cas9蛋白作为核酸内切酶在植物基因组目标靶点造成定点切割，从而引入位点特异性突变。但Cas9(SpCas9)识别PAM主要为NGG，这限制了基因组编辑范围。为了扩展其识别位点，许多科学家考虑通过改变PAM-interacting(PI)结构域的序列，使其可以识别更多种类的PAM类型。到目前为止，已经获得了几种识别不同PAM序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体，其特征在于，所述SpCas9-NRCH突变体为a1)、a2)或a3)：/na1)其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质；/na2)在a1)所示蛋白质的N末端添加一个甲硫氨酸残基，得到的蛋白质；/na3)在a1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体，其特征在于，所述SpCas9-NRCH突变体为a1)、a2)或a3)：
a1)其氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1所示的蛋白质；
a2)在a1)所示蛋白质的N末端添加一个甲硫氨酸残基，得到的蛋白质；
a3)在a1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。


2.一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体基因，其特征在于，所述SpCas9-NRCH突变体基因的序列为：
b1)序列表中SEQIDNo.2所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述SpCas9-NRCH突变体的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码SpCas9-NRCH突变体的DNA分子。


3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求2所述的SpCas9-NRCH突变体基因。


4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒具有式I结构：P-A-B-C-D(I)；
其中，
(a)P为启动子；
(b)A为无或核定位信号序列NLS；
(c)B为SpCas9-NRCH基因序列；
(d)C为无或核定位信号序列NLS；
(e)D为终止子，
并且，该式的附加条件为A和C中至多1个为无。


5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述启动子包括Ubi、Actin和35S启动子。


6.一种表达载体，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，许蓉芳，秦瑞英，刘小双，周桂林，范家萌，单调风，魏鹏程，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，合肥丰乐种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34