一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂及其制备方法和应用。所述复合制剂包括包括菌含量为5‑6×10

【技术实现步骤摘要】
一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂及其制备方法和应用
本专利技术属于水产养殖领域，具体涉及一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)是环境和动物肠道常见的革兰氏阳性菌，丁酸梭菌菌体可在肠道粘附占位，抑制病原菌；乳酸片球菌繁殖代谢中可以产生乳酸片球菌素和L-乳酸等益生物质，在肠道菌群平衡调节中起到重要作用。而目前由这两种参与制备的微生物菌剂主要遇到的问题是固体产品生产成本仍偏高，限制了使用频率；而液体产品因保存不稳定，造成不能大规模应用。因此，研发一种可以高效规模化生产、在运输和保存中稳定性高的产品，对厌氧菌在水产养殖中的应用具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂及其制备方法和应用，所述复合制剂通过培养条件摸索，具有很好的稳定性，便于储藏，且能够很好的提高水产动物生长性能。为实现上述专利技术目的，本专利技术通过下述技术方案予以实现：本专利技术提供了一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂，所述复合制剂包括菌含量为5-6×108CFU/mL的丁酸梭菌和菌含量为5.0-6.0×109CFU/mL的乳酸片球菌。进一步的，所述丁酸梭菌采用的是保藏编号为CGMCCNo.14499的丁酸梭菌GBW-N1。进一步的，所述复合制剂具有很好的稳定性。本专利技术还提供了所述的复合制剂的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：(1)将丁酸梭菌、乳酸片球菌分别在种子培养基中进行活化培养，得到丁酸梭菌种子液、乳酸片球菌种子液；(2)先将所述丁酸梭菌种子液接种到发酵罐中，37℃在发酵培养基中发酵4-5h后，再将所述乳酸片球菌种子液接种到发酵罐中，37℃共培养16-22h，得到所述复合制剂，灌装备用。进一步的，所述丁酸梭菌种子液的接种量为2％；所述乳酸片球菌种子液的接种量为2％。进一步的，所述发酵培养基的配方为胰蛋白胨6～12g/L、牛肉膏5～10g/L、酵母膏5～15g/L、葡萄糖20～30g/L、磷酸氢二钾2～5g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、乙酸钠1～3g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5～1g/L，碳酸钙10～20g/L，pH6.8～7.0。进一步的，所述步骤(2)中发酵的条件：高纯氮气控制罐体压力为0.05MPa，转速为80-100r/min，采用氢氧化钠溶液或氨水控制发酵培养基的pH≥6.0。本专利技术还提供了所述的复合制剂在用于制备提高水产动物生长性能的微生物制剂中的应用。进一步的，在应用时，将所述复合制剂以20-30mL/kg饲料的用量拌服在水产动物的养殖饲料中，连续饲喂30天以上。进一步的，所述复合制剂能够增加水产动物的增重率和成活率，并降低饵料系数。进一步的，所述复合制剂能够增加水产动物肠道绒毛数量、上皮细胞密度和血清中的碱性磷酸酶含量。进一步的，所述复合制剂能够明显降低弧菌数量。进一步的，所述水产动物包括南美白对虾。与现有技术相比，本专利技术方法的优点和技术效果是：本专利技术将对动物无毒害的丁酸梭菌和乳酸片球菌通过错时接种培养的方法制得复合菌剂，发酵过程中的培养基成分和pH均是通过精心的实验设计和验证的，有利于共培养时生长较弱的丁酸梭菌的生长，使其在22h内获得较高的菌数。所述的复合制剂不仅在南美白对虾养殖中能够提高其增重率、成活率和血清中碱性磷酸酶含量，还可以降低饵料系数、起到很好的抑菌效果，且该复合制剂稳定性佳，能够长期保存，因此其兼顾了生产、保存和应用效果，解决了丁酸梭菌和乳酸片球菌在水产养殖中推广中遇到的成本和稳定性问题，另外，复合菌剂比两者单独发酵再混合缩短了50％以上的培养周期，也解决了克服了产品的染菌、胀瓶等问题。附图说明图1为丁酸梭菌GBW-N1在TSC培养基上的菌落、菌体与芽孢图。图2为丁酸梭菌和乳酸片球菌共培养12h结晶紫染色100×10倍镜检。图3为丁酸梭菌和乳酸片球菌共培养的复合制剂的产品外观。图4为复合制剂带透气盖的塑料包装外观。图5为南美白对虾养殖的循环水养殖系统。图6为南美白对虾拖便和断肠情况图。图7为南美白对虾血清中酶活检测情况。图8为南美白对虾中肠组织切片。图9为南美白对虾肠道的菌群结构。具体实施方式结合以下具体实例对本专利技术的技术方案作进一步详细的说明。实施例1一、丁酸梭菌GBW-N1的筛选、分离与鉴定1、丁酸梭菌GBW-N1的分离筛选与纯化将采集样品培养的菌悬液，梯度稀释后涂布于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(TSC)培养基上，多次分离纯化后得到单菌落，命名为GBW-N1，保存。所述菌株GBW-N1的在TSC固体培养基上培养24h的菌落图1所示，其菌落图如1a，圆形，黑色，表面光滑，中间略凸起，边缘不整齐；所述菌株GBW-N1在TSC液体培养基上培养48h的菌体图1b所示，菌体呈杆状，1.1-1.2μm×2.1-3.6μm，单个排列，革兰氏阳性，芽胞呈梭状，中生，胞囊膨大。2、丁酸梭菌GBW-N1的分子鉴定以所述的菌株GBW-N1的DNA为模板，使用16SrRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-N1的16SrDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-N11与Clostridiumbutyricum同源性最高，因此确定该菌株GBW-N1为丁酸梭菌。3、丁酸梭菌GBW-N1的菌种保藏将筛选到的菌株GBW-N1进行菌种保藏，所述丁酸梭菌GBW-N1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年08月07日；丁酸梭菌Clostridiumbutyricum的保藏编号为CGMCCNo.14499。4、丁酸梭菌GBW-N1的菌株特性丁酸梭菌GBW-N1在pH值6～8的范围内均能生长，而最适的生长pH值为7.1-7.5；在溶氧含量1～5mg/L范围内都能正常生长，而最适的生长溶解氧浓度在2-4mg/L；能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，能够降解或分解动力-硝酸盐、西蒙式枸橼酸盐和半固体琼脂；在30～45℃温度范围内均能正常生长繁殖，而最适的生长温度在35～38℃。丁酸梭菌GBW-N1为厌氧菌，可在厌氧环境中萌发增殖，并发挥产酶、产酸、抑菌等益生功能。二、丁酸梭菌种子液的制备将丁酸梭菌GBW-N1单菌落接种于装有RCM培养基的克氏瓶中，37℃培养3d，用0.8％生理盐水将菌苔刮洗下作为种子液，后续使用。丁酸梭菌种子液的浓度为490万CFU/mL，用于后续试验。三、乳酸片球菌种子液的制备挑取培养在MRS固体培养基上的乳酸片球菌(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包括菌含量为5-6×10

【技术特征摘要】
1.一种含有丁酸梭菌和乳酸片球菌的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包括菌含量为5-6×108CFU/mL的丁酸梭菌和菌含量为5.0-6.0×109CFU/mL的乳酸片球菌。


2.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述丁酸梭菌采用的是保藏编号为CGMCCNo.14499的丁酸梭菌GBW-N1。


3.权利要求1或2所述的复合制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)将丁酸梭菌、乳酸片球菌分别在种子培养基中进行活化培养，得到丁酸梭菌种子液、乳酸片球菌种子液；
(2)先将所述丁酸梭菌种子液接种到发酵罐中，37℃在发酵培养基中发酵4-5h后，再将所述乳酸片球菌种子液接种到发酵罐中，37℃共培养16-22h，得到所述复合制剂，灌装备用。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述丁酸梭菌种子液的接种量为2％；所述乳酸片球菌种子液的接种量为2％。


5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婷婷，王金龙，梁晶晶，李明霞，闫舟，梁奕，张宗国，
申请(专利权)人：青岛尚德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37