工程化嘌呤核苷磷酸化酶变体酶制造技术

本发明专利技术提供了工程化嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)酶、具有PNP活性的多肽，和编码这些酶的多核苷酸，以及包含这些多核苷酸和多肽的载体和宿主细胞。还提供了用于产生PNP酶的方法。本发明专利技术还提供了包含PNP酶的组合物，以及使用工程化PNP酶的方法。本发明专利技术尤其可用于药物化合物的产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化嘌呤核苷磷酸化酶变体酶本申请要求2018年7月9日提交的美国临时专利申请系列第62/695,507号和2019年3月22日提交的美国临时专利申请系列第62/822,263号的优先权，为了所有目的通过引用将两份美国临时专利申请系列以其整体并入本文。专利
本专利技术提供了工程化嘌呤核苷磷酸化酶(purinenucleosidephosphorylase,PNP)酶、具有PNP活性的多肽，和编码这些酶的多核苷酸，以及包含这些多核苷酸和多肽的载体和宿主细胞。还提供了用于产生PNP酶的方法。本专利技术还提供了包含PNP酶的组合物，以及使用工程化PNP酶的方法。本专利技术尤其可用于药物化合物的产生。对序列表、表格或计算机程序的引用序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件经由EFS-Web与说明书同时提交，文件名为“CX2-172WO1_ST25.txt”，创建日期为2019年6月25日，且大小为1,547千字节。经由EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。专利技术背景被称为人类免疫缺陷病毒(HIV)的逆转录病毒是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是一种复杂的疾病，涉及受影响个体的免疫系统的逐渐破坏以及中枢和外周神经系统的退化。逆转录病毒复制的一个共同特征是通过病毒编码的逆转录酶对病毒RNA基因组进行逆转录，以产生病毒复制所需的HIV序列的DNA拷贝。一些化合物诸如MK-8591是已知的逆转录酶抑制剂，并可用于治疗AIDS和类似疾病。虽然存在已知抑制HIV逆转录酶的一些化合物，但是在本领域中仍然需要能够更有效地抑制这种酶并从而改善对AIDS的效果的另外的化合物。由于其与用于合成DNA的天然核苷的相似性，核苷类似物诸如MK-8591(Merck)是HIV的逆转录酶的有效抑制剂。逆转录酶与这些类似物的结合通过抑制逆转录酶的前进性性质(progressivenature)来使DNA的合成停滞。酶的停滞导致DNA分子的提前终止，使其无效。然而，通过标准化学合成技术产生核苷类似物可能由于其化学复杂性而具有挑战。专利技术概述本专利技术提供了工程化嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)酶、具有PNP活性的多肽，和编码这些酶的多核苷酸，以及包含这些多核苷酸和多肽的载体和宿主细胞。还提供了用于产生PNP酶的方法。本专利技术还提供了包含PNP酶的组合物，以及使用工程化PNP酶的方法。本专利技术尤其可用于药物化合物的产生。本专利技术提供了工程化嘌呤核苷磷酸化酶，所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶包含与SEQIDNO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:2编号。在一些实施方案中，工程化嘌呤核苷磷酸化酶包含与SEQIDNO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、12、12/42、12/74/80/101/162/214/215、12/74/101、12/80/162/210/215、12/80/210、12/162、12/165/173/210/214、12/187、12/210、20/90、21、25、42、45、65、69、72、91、95/178/199、105、111、115、155、162、164、171/176/199、176/178/199、176/199、177、178、178/199、179、181、184、199、202、204、207和212，其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:2编号。在一些另外的实施方案中，所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列包含选自以下的至少一个取代或取代集：2N、2P、2S、2T、12A、12A/42D、12A/74A/80E/101V/162T/214S/215S、12A/74A/101V、12A/80E/162T/210G/215S、12A/80E/210G、12A/162T、12A/165P/173N/210G/214S、12A/210G、12F、12K/187H、12L、12S、20S/90L、21R、25L、42D、45T、45W、65A、65P、65S、65T、69K、72A、72L、72M、72T、72V、91T、95I/178A/199A、105L、111M、115G、115R、115V、155H、162A、162R、164E、164V、171L/176V/199A、176V/178A/199A、176V/199A、177V、178A、178A/199A、179T、181L、184S、199A、202V、204A、207C和212A，其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:2编号。在又一些另外的实施方案中，所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列包含选自以下的至少一个取代或取代集：A2N、A2P、A2S、A2T、D12A、D12A/N42D、D12A/T74A/D80E/L101V/S162T/T214S/A215S、D12A/T74A/L101V、D12A/D80E/S162T/H210G/A215S、D12A/D80E/H210G、D12A/S162T、D12A/G165P/K173N/H210G/T214S、D12A/H210G、D12F、D12K/Y187H、D12L、D12S、P20S/G90L、G21R、R25L、N42D、G45T、G45W、M65A、M65P、M65S、M65T、S69K、I72A、I72L、I72M、I72T、I72V、S91T、V95I/G178A/T199A、V105L、C111M、K115G、K115R、K115V、F155H、S162A、S162R、D164E、D164V、M171L/I176V/T199A、I176V/G178A/T199A、I176V/T199A、L177V、G178A、G178A/T199A、V179T、M181L、A184S、T199A、T202V、S204A、I207C和Q212A，其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:2编号。本专利技术提供了工程化嘌呤核苷磷酸化酶，所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶包含与SEQIDNO:6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:6编号。在一些实施方案中，工程化嘌呤核苷磷酸化酶包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化嘌呤核苷磷酸化酶，所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶包含与SEQ ID NO:2、6、126、242和/或684具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQ ID NO:2、6、126、242和/或684编号。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180709 US 62/695,507;20190322 US 62/822,2631.一种工程化嘌呤核苷磷酸化酶，所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶包含与SEQIDNO:2、6、126、242和/或684具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:2、6、126、242和/或684编号。


2.根据权利要求1所述的工程化嘌呤核苷磷酸化酶，其中所述多肽序列与SEQIDNO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且其中所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：65、2、12、12/42、12/74/80/101/162/214/215、12/74/101、12/80/162/210/215、12/80/210、12/162、12/165/173/210/214、12/187、12/210、20/90、21、25、42、45、69、72、91、95/178/199、105、111、115、155、162、164、171/176/199、176/178/199、176/199、177、178、178/199、179、181、184、199、202、204、207和212，其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:2编号。


3.根据权利要求1所述的工程化嘌呤核苷磷酸化酶，其中所述多肽序列与SEQIDNO:6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且其中所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、2/65、12/42/65、12/65、12/65/74/80/101/162/214/215、12/65/74/101、12/65/80/210、12/65/162、12/65/165/173/210/214、21/65、38、42、42/155、42/177、45/65、54、65/72、65/91、65/105、65/115、65/202、65/212、80、80/95、80/155、80/175、84、91、91/115、95、95/101、95/155、95/155/215、95/212、95/212/215、101、101/105、101/187、101/212、105/155/212/215、108、155、155/177/204、155/184/212/215、155/212、162/199、175、177、184/212/215、199、212、212/215和215，其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:6编号。


4.根据权利要求1所述的工程化嘌呤核苷磷酸化酶，其中所述多肽序列与SEQIDNO:126具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，并且其中所述工程化嘌呤核苷磷酸化酶的多肽序列在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、2/80/95、2/80/95/155、2/80/95/155/199/212、2/80/95/199、2/80/95/199/212、2/80/101/155/212、2/80/101/212、2/80/155/177/215、2/80/155/215、2/80/175/199、2/80/175/199/212/215、2/80/177、2/80/199/212/215、2/80/215、2/95、2/95/155、2/95/155/199、2/95/155/199/212/215/223、2/95/155/199/215、2/95/155/215、2/95/175、2/95/199、2/95/199/212/215、2/95/212/215、2/95/215、2/101/155、2/155、2/155/177/212、2/155/199、2/199、2/199/212/215、2/212/215、2/215、28、39、42、45、53、54/173、57/175、75、80、80/95/101/155/199、80/95/101/155/199/215、80/95/101/199、80/95/155、80/95/155/175/199/212/215、80/95/155/199、80/95/155/199/212、80/95/155/199/215、80/95/155/212/215、80/95/177、80/95/177/199、80/95/177/212/215、80/95/215、80/101、80/155、80/155/177/199、80/155/177/212/215、80/155/199、80/199、80/212、84、85、95、95/155、95/155/177、95/155/177/199、95/155/177/199/212、95/155/199、95/155/212/215、95/177/199、95/199、95/212、95/212/215、95/215、98、101、101/155/199、101/155/199/212、101/177/212、101/215、119、123、124、129、130、131、132、136、137、139、140、143、144、148、148/175、150、151、152、153、155、155/199、155/212/215、160、170/203、173、175/212、177、177/199、191、191/237、196、199、199/212、210、212、212/215、216和220，其中所述多肽序列的氨基酸位置参照SEQIDNO:126编号。


5.根据权利要求1所述的工程化嘌呤核苷磷酸化酶，其中所述多肽序列与SEQIDNO:242具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯科特·J·诺维克，尼基·德拉斯，韦丝娜·米切尔，段达，约瓦娜·纳佐尔，奥斯卡·阿尔维左，奥里克·安东尼·索厄尔肯士，杰弗里·C·穆尔，马克·霍夫曼，阿古斯蒂纳·罗德里格斯格拉尼利奥，迪帕克·维尔玛，尼古拉斯·M·马歇尔，杰伊·拉塞尔，基思·A·卡纳达，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：美国;US