一种多能修复细胞MDMC的提取制备工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种多能修复细胞MDMC的提取制备工艺，包括以下步骤：1）从外周血中分离提取单核细胞PBMC；2）选择对应体积的培养瓶，将步骤1）提取的单核细胞PBMC进行铺瓶培养；3）将步骤2）培养中的细胞在D1天和D4天进行换液；4）将步骤3）培养中的细胞在D7天进行收获，得到多能修复细胞MDMC。多能修复细胞MDMC。多能修复细胞MDMC。

【技术实现步骤摘要】
800
‑
1000ng/ml。
[0011]优选地，步骤4）中，采用以下方法收获：4
‑
1) 将T175培养瓶中上清液弃掉，加入5ml PBS清洗细胞，弃去细胞洗液；4
‑
2) 向培养瓶中加入1ml胰蛋白酶（优选0.25% Trypsin
‑
EDTA），置37℃，5%CO2条件下孵育培养5min；4
‑
3) 向培养瓶内加入5ml胰蛋白酶抑制剂；4
‑
4) 使用细胞刮刀刮下贴壁细胞并收集到50ml离心管中，加入PBS定容至45ml，1000rpm，离心10min；4
‑
5) 弃上清，加入10ml PBS将细胞沉淀吹打混匀，经100
µ
m细胞筛过滤至新的250ml离心管内补加PBS至200ml；4
‑
6) 1000rpm，离心10min后，弃上清，沉淀即多能修复细胞MDMC。
[0012]本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供的无血清培养成分明确，安全性高，单个核细胞经过本专利技术工艺诱导培养后，获得了以往传统培养方式不易培养出的干性细胞和巨噬细胞混合细胞，且以往各种传统培养出的细胞没有相同效应的效果；另外本专利技术中培养诱导方法简单，高效，有利于规模化生产。
附图说明
[0013]图1为本专利技术多能修复细胞MDMC的提取制备工艺流程图。
[0014]图2为本专利技术实施例中细胞计数结果图。
[0015]图3为本专利技术实施例中细胞流式检测结果图。r/>具体实施方式
[0016]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0017]如未有特殊说明，实施例中各个步骤均可采用本领域现有材料及常规技术手段来实现。
实施例
[0018]1. 培养基配制：1) 500ml培养基1：RPMI 1640加入M
‑
CSF因子1支（biolegend；5
‑
20μg/L），IL
‑
3因子1支（biolegend；0.5
‑
1.5μg/L），50ml（10%）灭活自体血清以及5μl巯基乙醇；2) 500ml培养基2：500ml培养基1+FGF因子1支（biolegend；2μg/L），EGF因子1支（biolegend；2μg/L），IL
‑
2因子1支（biolegend；800
‑
1000ng/ml）。
[0019]注：培养基中各添加物的浓度/体积均为各添加物在培养基最终总体积中的最终浓度/体积。
[0020]2. 人外周血分离提取单核细胞：
1) 将采血管或采血袋用浸润酒精的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，血样来自合作医院，且按照使用要求与被采血者签署知情同意书；2) 将血样平均分装到50ml离心管中，取20
µ
l血样涂至血平皿标记后置恒温培养箱培养，培养温度35℃，培养时间7Day。另取20
µ
l和100
µ
l血样至EP管中，分别进行血细胞计数、流式细胞检测；3) 将分装至离心管的血液，2000rpm（升速9、降速7）常温离心10min；4) 用生理盐水按1:1的比例稀释离心后获得的血细胞，倾斜装有Ficoll的离心管，缓慢地将稀释后血样加到Ficoll液面上，使其呈清晰界面，血样与Ficoll比例不超过2:1，1600rpm（升速6、降速4）离心20min；5) 使用10ml吸弃上清，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，1500rpm（升速9、降速9）离心10min离心后，弃去上清，沉淀先用5ml生理盐水重悬，再加生理盐水至45ml，混匀，取1ml样本于EP管中，用于计算细胞总量，1300rpm（升速9、降速9）离心10min弃上清，沉淀即所需单核细胞。
[0021]3. 根据计算结果选择对应T175培养瓶——细胞总数：30
‑
35
×
106，加入30 ml培养基1，37℃，5% CO2培养箱，孵育培养，并标记为D0天。
[0022]4. 细胞换液：1) Day1：弃去培养瓶内的培养基1，补加10 ml（T175）新鲜培养基1到培养瓶内；37℃，5% CO2培养箱，孵育培养；2) Day4，显微镜下观察细胞形态，弃去15ml培养基1并补加15ml培养基2，置37℃，5% CO2培养箱孵育；5. 细胞收获：1) 收获前先进行显微镜评估+照相；2) 将T175培养瓶中上清液弃掉，加入5ml PBS清洗细胞，弃去细胞洗液；3) 向培养瓶中加入1ml胰酶Trypsin
‑
EDTA(0.25%)，置37℃，5%CO2培养箱，孵育5min；4) 向培养瓶内加入5ml Trypsin inhibitor；5) 使用细胞刮刀刮下贴壁细胞并收集到50ml离心管中，加入PBS定容至45ml，1000rpm，离心10min；6) 弃上清，加入10ml PBS将细胞沉淀吹打混匀，经100
µ
m细胞筛过滤至新的250ml离心管内补加PBS至200ml，留20
µ
l样品进行细胞计数（附图1），细胞总数为1.166*10^9；7) 留1ml样品至无菌EP管内进行无菌、内毒素检测且检测结果均为阴性；留1ml样品至无菌EP管进行细胞流式检测（附图2）：从附图2中可证明经过上述培养后，单核细胞可被诱导形成标记物为CD68、CD163的M2型巨噬细胞和高表达标记物为CD90的干细胞类细胞的混合细胞，即MDMC；第一组：阴性对照；第二组：CD68
‑
PE
‑
Cy7，CD90
‑
APC，7AAD；第三组：CD14
‑
APC，CD16
‑
PE，CD163
‑
BV421；第四组：本实施例；8) 1000rpm，离心10min后，弃上清，沉淀即多能修复细胞（MDMC）。
[0023]MDMC主要含有的M2型巨噬细胞，可以消除病变部位的炎症，能够很好的抑制炎症反应，为组织修复提供一个良好的环境。MDMC中含有单核细胞衍化的类干细胞，在损伤部位归巢，分化成组织细胞，并分泌生长因子启动组织干细胞生长，起到修复组织结构，恢复组织功能的作用。
[0024]本专利技术提供的无血清培养成分明确，安全性高，单个核细胞经过本专利技术工艺诱导培养后，获得了以往传统培养方式不易培养出的干性细胞和巨噬细胞混合细胞，且以往各种传统培养出的细胞没有相同效应的效果；另外本专利技术中培养诱导方法简单，高效，有利于规模化生产。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多能修复细胞MDMC的提取制备工艺，包括以下步骤：1） 从外周血中分离提取单核细胞PBMC；2） 选择对应体积的培养瓶，将步骤1）提取的单核细胞PBMC进行铺瓶培养；3） 将步骤2）培养中的细胞在D1天和D4天进行换液；4） 将步骤3）培养中的细胞在D7天进行收获，得到多能修复细胞MDMC。2.根据权利要求1所述的一种多能修复细胞MDMC的提取制备工艺，其特征在于，步骤1）中，采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离提取单核细胞PBMC。3.根据权利要求1所述的一种多能修复细胞MDMC的提取制备工艺，其特征在于，步骤2）中，根据实验计划或细胞总量计算结果选择对应体积的培养瓶。4. 根据权利要求1所述的一种多能修复细胞MDMC的提取制备工艺，其特征在于，步骤2）中，加入培养基1，37℃，5% CO2条件下孵育培养，并标记为D0天；培养基1的配方为：RPMI 1640加入M
‑
CSF因子5
‑
20μg/L，IL
‑
3因子0.5
‑
1.5μg/L，10%灭活自体血清以及10μl/L巯基乙醇。5.根据权利要求4所述的一种多能修复细胞MDMC的提取制备工艺，其特征在于，步骤2）中，采用以下标准进行铺瓶培养：a. 每个T25培养瓶细胞总数：2.0
‑
5.0
×
106，培养基1用量：5ml；b. 每个T175培养瓶细胞总数：11.5
‑
15.0
×
106，培养基1用量：10ml；c. 每个T175培养瓶细胞总数：30.0
‑
35.0
×
106，培养基1用量：30ml。6. 根据权利要求4所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈力坚，徐云龙，郎辰宇，任卓亚，孙佳冬，
申请(专利权)人：北京博奥体质宝健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：