一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，属于生物工程技术领域。其制备步骤如下：取细胞，加入到培养液中，进行培养，待细胞长满90％后，进行切应力处理，收集细胞并涡旋后，离心，取上清液再次离心，得沉淀；将沉淀置于磷酸盐缓冲盐水中，吹打混匀后离心，取上清液再次离心，得二次沉淀，加入水进行低渗处理，离心后，即得。本发明专利技术的基于切应力刺激用于制备微囊泡的方法，可较方便快速得到含量较多的EVs，同时在制备过程中，不需要化学试剂刺激，不会产生非均相聚合物颗粒，节省了人力、物力和财力；制得的细胞微囊泡，大小均一，平均粒径为231nm，在生物材料领域，具有推广应用价值。广应用价值。广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法。

技术介绍

[0002]细胞微囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)直径大多为100-1000nm，是由细胞膜出芽形成，细胞通过释放EVs以应答细胞激活、pH值变化、缺氧、辐射、损伤或者细胞应激等细胞生理喝病理的改变，微囊泡出芽也被认为是质膜损伤后修复破损质膜的一个机制。EVs可在许多体液中被发现，包括血液、尿液、眼泪和唾液，并参与多种生理和病理过程，如心血管疾病。现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信、疾病诊断和预后的循环标志物的重要载体。但细胞产生EVs的量本身不大，且EVs在提取的过程中纯度不高，加上后续鉴定分离使其损失较大，从而限制了EVs的应用和发展。
[0003]现有的常规提取EVs的方法：将巨噬细胞用细胞松弛素(CB)处理2h后，将细胞用细胞刮刮下，3000rmp/min离心5min，再10000rmp/min离心10min，PBS清洗两遍备用。
[0004]常规的离心方法是应用最广泛的，但存在许多缺点，如试剂花费大、处理时间长、过程繁琐、操作过程中容易污染等。而且对于EVs来说缺乏特异性，容易产生非均相聚合物颗粒，以及提取的EVs浓度不均一等问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，目的之二在于提供一种细胞微囊泡，目的之三在于提供一种细胞微囊泡的应用。
[0006]经研究，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]1、一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
[0008]1)取细胞，加入到培养液中，在35～38℃条件下，进行细胞培养至90％融合；
[0009]2)将培养至90％融合的细胞放置于轨道摇床(orbital shaker)细胞培养装置上进行切应力处理，条件为：转速20～70r/min，时间为2～6h；切应力处理后用细胞刮将细胞刮下，收集细胞并涡旋0.5～1min，离心，取上清液再次离心，得沉淀；
[0010]3)将沉淀置于磷酸盐缓冲盐水中，吹打混匀后离心，取上清液再次离心，得二次沉淀；
[0011]4)向二次沉淀中加入纯水进行低渗处理15～30min，离心后，即得细胞微囊泡。
[0012]其中，步骤1)中，摇床培养的时间为4～6min。轨道摇床培养的温度为37℃。细胞培养至约90％融合表示为将细胞培养增殖量至培养瓶体积的90％。步骤2)中，所述将细胞进行切应力处理即指在轨道摇床上以转速为20～70r/min进行培养。
[0013]优选的，所述步骤1)中，细胞包括免疫细胞、内皮细胞或平滑肌细胞。
[0014]优选的，所述巨噬细胞由RAW264.7细胞系中提取而得。其中，本申请中的巨噬细胞为直接购买而得。
[0015]优选的，所述步骤1)中，培养液包括DMEM培养基和10％的血清。
[0016]更优选的，所述步骤1)中，培养液的加入量为，每50mL培养瓶中加入3mL的培养液，细胞培养至整个培养瓶总体积的90％后，结束培养，此时培养瓶中的巨噬细胞约1
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108个。
[0017]优选的，所述步骤2)中，切应力处理的条件为50r/min，时间为2h。
[0018]优选的，所述步骤2)中，涡旋的时间为30s，离心的转速为1000rmp，时间为5min，再次离心的转速为10000rmp，时间为10min。
[0019]优选的，所述步骤3)中，离心的转速为1500rmp，时间为5min，再次离心的转速为10000rmp，时间为15min。
[0020]优选的，所述步骤3)中，磷酸盐缓冲盐水需用200nm孔径过筛处理。
[0021]优选的，所述步骤4)中，低渗处理的时间为20min，离心的转速为10000rmp，时间为10min。
[0022]2、上述制备方法制得的细胞微囊泡。
[0023]3、上述制备方法制得的细胞微囊泡作为药物载体的应用。
[0024]一直以来，对药物载体的研究只停留在化学合成的方法之上，直到EVs的出现，药物学研究人员已成功地将EVs应用于药物载体系统，并开发了多种给药途径，包括经静脉注射、局部注射以及口服等，大大扩展了药物的利用方式。作为药物载体，EVs赋予药物分子靶向功能，增加相关药物的溶解度和药物的生物利用度，作为一种自身细胞产物，在体内运输期间也大大降低了药物的免疫原性，减少了对自身细胞的毒副作用。EVs在药物载体领域的应用已显示出无可比拟的优势和应用前景，作为纳米级天然药物载体已被成功地用于传递多种物质，如小分子化学药物、Lnc RNA、si RNA、mi RNA、m RNA、DNA以及蛋白质等。EVs作为一种新的无细胞疾病诊断和治疗策略正在被研究，并引起了多个生物医学领域的广泛关注。越来越多的证据表明，EVs由于其独特的生理生化特性，在疾病诊断和治疗中发挥着重要作用。
[0025]本专利技术的有益效果在于：
[0026]1)本专利技术的基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，可快速得到含量较多的EVs，且实验过程对仪器的要求比较低，操作简单，减少了复杂的样品处理步骤以及解决了耗时过长的问题，同时在制备过程中，不需要CB刺激，不会产生非均相聚合物颗粒，节省了人力、物力和财力；
[0027]2)本专利技术制得的细胞微囊泡(EVs)，大小均一，平均粒径为231nm，电位为-20.9，稳定性好，在生物材料领域，具有推广应用价值。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例1中制得的细胞微囊泡的扫描电镜图；
[0029]图2为本专利技术实施例1中制得的细胞微囊泡的粒径分布图；
[0030]图3为本专利技术实施例1中制得的细胞微囊泡的电位分布图；
[0031]图4为本专利技术的巨噬细胞的细胞膜的电位分布图；
[0032]图5为本专利技术制得的细胞微囊泡的蛋白定量分析图；
[0033]图6为本专利技术实施例1中制得的细胞微囊泡的WB分析图。
具体实施方式
[0034]下面结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0035]实施例1
[0036]基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
[0037]1)从RAW 264.7细胞系中提取得到的巨噬细胞，加入到50mL的培养瓶中，并向培养瓶中加入3mL的DMEM培养基和10％的普通血清制得的培养液，置于37℃培养箱中培养，待细胞增殖至整个培养瓶总体积的90％后，结束培养，此时培养瓶中的细胞约1
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108个；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取细胞，加入到培养液中，在35～38℃条件下，进行细胞培养至90％融合；2)将培养至90％融合的细胞放置于轨道摇床(orbital shaker)细胞培养装置上进行切应力处理，条件为：转速20～70r/min，时间为2～6h；切应力处理后用细胞刮将细胞刮下，收集细胞并涡旋0.5～1min，离心，取上清液再次离心，得沉淀；3)将沉淀置于磷酸盐缓冲盐水中，吹打混匀后离心，取上清液再次离心，得二次沉淀；4)向二次沉淀中加入纯水进行低渗处理15～30min，离心后，即得细胞微囊泡。2.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤1)中，细胞包括免疫细胞、内皮细胞或平滑肌细胞。3.根据权利要求2所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述巨噬细胞由RAW264.7细胞系中提取而得。4.根据权利要求1所述基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述步骤1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贵学，王良婷，王溢，吴伟，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：