天蓝色链霉菌突变菌株，利用其的β-琼脂糖酶生产方法及利用其的新琼寡糖制备方法技术

本发明专利技术提供一种通过紫外线照射而使存在于野生型天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)菌株的DagB基因的碱基序列发生点突变的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)_M22

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】天蓝色链霉菌突变菌株，利用其的
β
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琼脂糖酶生产方法及利用其的新琼寡糖制备方法


[0001]本专利技术涉及一种天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)突变菌株，利用其的β
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琼脂糖酶(Beta
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agarase)生产方法及利用其的新琼寡糖(Neoagaro
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oligosaccharides)制备方法，更具体地，涉及一种与亲本菌株相比主要表达DagA酶的天蓝色链霉菌突变菌株，利用其来大量生产β
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琼脂糖酶中DagA酶的方法，以及利用其从琼脂或琼脂糖制备新琼四糖(neoagarotetraose)或新琼六糖(neoagarotetraose)的含量比新琼二糖(neoagarobiose)更高的新琼寡糖的方法。

技术介绍

[0002]很久以来，琼脂作为被广泛应用于食品添加剂、医药品、化妆品、家畜饲料和工业原料等的代表性的多糖类(来源于海藻类)，在韩国国内，其为每年生产量大约达到2000～5000吨的比较丰富的水产资源中的一个。然而，在实际使用中，仅仅简单地加工处理全部产品的一部分而用作廉价的原材料，其余大部分则被弃置，因此与富集的资源量相比，其处于一种附加价值非常低的处境。因此，实际上，迫切需要关于丰富的国内琼脂的新用途和提高其附加价值的研究。
[0003]除少量的蛋白质、灰分及脂肪以外，琼脂大部分是由多糖组成，并且构成上述琼脂的多糖中含有作为中性多糖的琼脂糖(agarose)和作为酸性多糖的琼脂胶(agaropectin)。琼脂糖将D
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半乳糖(D
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galactose)和3,6
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内醚
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L
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半乳糖(3,6
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anhydro
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L
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galactose)以β
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1,4形式进行结合的琼脂二糖(agarobiose)作为单体，并且，由于琼脂二糖具有以α
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1,3键的形式重复连接的直链结构，因此凝胶(gel)化能力强。相反，琼脂胶与琼脂糖一样，同样将琼脂二糖作为单体，但是由于琼脂胶含有如硫酸基等酸性基图案，因此凝胶化能力较弱。其中，琼脂糖通过作用于β
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1,4键的β
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琼脂糖酶(β
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agarase)而经过新琼四糖(neoagarotetraose)被分解为新琼二糖(neoagarobiose)，进一步通过作用于α
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1,3键的α
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琼脂糖酶(α
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agarase)而最终被分解为D
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半乳糖(D
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galactose)和3,6
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内醚
‑
L
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半乳糖(3,6
‑
anhydro
‑
L
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galactose)。另外，琼脂糖能通过稀酸或α
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琼脂糖酶(α
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agarase)而被分解为琼脂二糖(agarobiose)。通常，新琼寡糖意味着通过β
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琼脂糖酶(β
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agarase)对琼脂或琼脂糖进行水解而获得的如新琼二糖(neoagarobiose)、新琼四糖(neoagarotetraose)、新琼六糖(neoagarohexaose)、新琼八糖(neoagarooctaose)等2～10个程度的单糖结合而成的寡糖。另外，琼脂寡糖意味着通过稀酸或α
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琼脂糖酶(α
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agarase)对琼脂或琼脂糖进行水解而获得的如琼脂二糖(Agarobiose)、琼脂四糖(Agarotetraose)、琼脂六糖(Agarohexaose)、琼脂八糖(Agarooctaose)等2～10个程度的单糖结合而成的寡糖。新琼寡糖将3,6
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内醚
‑
L
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半乳糖(3,6
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anhydro
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L
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galactose)作为非还原性末端，相反，琼脂寡糖将D
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半乳糖(D
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galactose)作为非还原性末端，由于这样的结构性差异，因此在生理学活性方面也可以显示出相互不同的性质。
[0004]另一方面，已知作为放线菌的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)将
分解琼脂或琼脂糖(agarose)的β
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琼脂糖酶(β
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agarase)以细胞外(分泌至细胞外的)蛋白质形态进行生产(Stanier等,1942,细菌学杂质；Hodgson and Chater,1981,J.Gen.Microbiol.)，该琼脂糖酶是通过DagA基因或DagB基因来进行编码的。天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)所生产的β
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琼脂糖酶(β
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agarase)中，DagA酶主要通过分解琼脂或琼脂糖(agarose)来生成DP4(新琼四糖)及DP6(新琼六糖)，DagB酶主要通过分解琼脂或琼脂糖(agarose)来生成DP2(新琼二糖)。另外，据报告，在琼脂或琼脂糖(agarose)的β
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琼脂糖酶(β
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agarase)反应产物中的DP4(新琼四糖)和DP6(新琼六糖)相比DP2(新琼二糖)具有更高的抗肥胖，抗糖尿，改善高血脂症等代谢疾病，抗癌，增强免疫的功效，因此，DagA基因在通过放线菌生产琼脂糖酶的研究中具有重要的地位。尤其，天蓝色链霉菌在分子生物学研究中作为最广泛使用的菌株，其染色体DNA的序列在2002年由英国的桑格中心(Sanger centre)进行了分析，目前已经发表(Bantley等，2002，自然)。
[0005]关于新琼寡糖的制备和用途，韩国授权专利第10
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0794593号中公开了一种具有琼脂分解能力的海洋细菌属菌株SL
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5(Thalassomonas sp.SL
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5)KCCM 10790P和利用上述菌株所生产的β
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琼脂糖酶(β
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agarase)来制备新琼寡糖的方法，所述新琼寡糖为选自由新琼二糖、新琼四糖及新琼六糖所组成的组中的一种以上。另外，韩国授权专利公报第10
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1072503号中公开了一种居水菌属菌株SL
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12KCCM 10945P(Glaciecola sp.SL
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12KCCM 10945P)和利用上述菌株所生产的β
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琼脂糖酶(β
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agarase)来制备新琼寡糖的方法，其中新琼寡糖为选自由新琼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种保藏编号为KCCM12577P的天蓝色链霉菌A3(2)_M22
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2C43菌株。2.根据权利要求1中所述的保藏编号为KCCM12577P的天蓝色链霉菌A3(2)_M22
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2C43菌株，其特征在于，包含通过基因突变而修饰的DagB基因，所述DagB基因由SEQ ID NO.2的碱基序列构成的。3.根据权利要求2中所述的保藏编号为KCCM12577P的天蓝色链霉菌A3(2)_M22
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2C43菌株，其特征在于，通过所述修饰的DagB基因表达的DagB突变酶由SEQ ID NO.6的氨基酸序列组成。4.一种β
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琼脂糖酶生产方法，其特征和在于，包括：(a)将根据权利要求1至3中任一项所述的保藏编号为KCCM12577P的天蓝色链霉菌A3(2)_M22
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2C43菌株接种于作为碳源含有半乳糖的液体培养基，并通过培养获得培养液的步骤；(b)通过离心所述培养液来获得上层液的步骤。5.一种β
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琼脂糖酶生产方法，其特征和在于，包括：(a)将根据权利要求1至3中任一项所述的保藏编号为KCCM12577P的天蓝色链霉菌A3(2)_M22
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2C43菌株接种于作为碳源含有半乳糖的液体培养基，并通过培养获得培养液的步骤；(b)通过离心所述培养液来获得上层液的步骤；(c)通过将硫酸铵添加到所述上层液中，使上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李济贤，金恩妵，李娟嬉，
申请(专利权)人：达因比奥有限公司，
类型：发明
国别省市：