一种益生菌模拟物及其制备方法技术

本发明专利技术属于益生菌模拟物制备技术领域，公开了一种益生菌模拟物及其制备方法。所述益生菌模拟物制备方法，包括：在补充胎牛血清的改良的培养基中培养细胞；在细胞第30

【技术实现步骤摘要】
一种益生菌模拟物及其制备方法


[0001]本专利技术属于益生菌模拟物制备
，尤其涉及一种益生菌模拟物及其制备方法。

技术介绍

[0002]目前，毒品滥用问题非常严重。药物依赖与酒精依赖等物质依赖的神经学原理类似，益生菌或益生元调节肠道微生物群是治疗物质依赖的一种有前途和安全的方法。为了评估益生菌和/或益生元对物质依赖的影响，尤其是对成瘾的不同行为方面，如抑郁、焦虑、压力反应、认知、冲动和药物寻求行为的影响，肯定需要进行前瞻性、随机、安慰剂对照的临床试验。
[0003]甲基苯丙胺成瘾者肠道菌群改变，宁婷婷建立了对甲基丙苯胺(MA)产生依赖的大鼠的条件性位置偏爱模型，然后收集大鼠的粪便，进行16srDNA测序发现，在对甲基丙苯胺成瘾的大鼠的肠道微生物与普通饲养的大鼠比较，许多特异的微生物类群发生了变化，其中值得引起注意的有厚壁菌门(产丙酸)的属的相对含量在对冰毒成瘾的大鼠体内下降。后续的气相色谱
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质谱检测进一步证实了肠道内丙酸含量也显著下降。因为丙酸与脑
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肠轴功能存在密切的关系，而且更为重要的是通过饮食添加丙酸可以显著改善多种精神症状。除此之外，瘤胃菌科的两个属的含量因为对冰毒成瘾而上升，瘤胃菌科被报道与位置记忆呈负相关，与压力呈正相关。因此，该菌类群的变化可以部分说明MA成瘾的一些症状的原因。Fulcher等的研究也表明，甲基苯丙胺的使用是导致肠道微生物改变的重要因素。在这项纳入37名人类免疫缺陷病毒
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1(human immunodeficiency virus
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1，HIV
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1)阳性的男性同性性行为受试者的研究中，甲基苯丙胺的使用与肠道微生物中卟啉菌属(Porphyromonas)以及颗粒链菌属(Granulicatella)细菌丰度的升高，瘤胃球菌属(Ruminococcus)、柯林斯氏菌属(Collinsella)以及副杆状菌属(Parabacteroides)细菌丰度的降低有关。
[0004]目前尚未发现肠道微生物在甲基苯丙胺依赖中的作用或调控机制的相关研究。基于有限的证据，Prakash等提出如下假设：甲基苯丙胺的使用导致肠道屏障及血脑屏障的通透性增高，使肠道微生物及其代谢产物能够穿过被削弱的屏障结构，在循环系统的介导下从肠道进入大脑，并引起一系列的外周及中枢神经系统的免疫炎症反应。上述假设提示，在甲基苯丙胺的作用下，肠道会产生炎症导致肠道屏障功能丧失等一系列肠道疾病问题。针对由甲基苯丙胺引发的肠道疾病问题进行缓解和治疗，可能会对甲基苯丙胺产生正面积极的戒断作用。
[0005]益生菌对于甲基苯丙胺成瘾的作用，益生菌目前已经被证实可以改善不同人群的生理和心理状态。益生菌的摄入，有助于改善个体对疼痛和负面情绪的整体认知性反应。定期服用含有双歧杆菌和乳杆菌的制剂，较低了肠易激综合征(IBS)患者的焦虑情绪，并降低了大脑杏仁核和额叶边缘区域对于负面情绪刺激的反应。Taylor等人发现成人健康女性的焦虑情绪与双歧杆菌数成反比；补充益生菌，同时接受适度的抵抗力训练对于老年人的认知及焦虑功能有显著改善；对于IBS患者以及精神分裂症患者，接受益生菌制剂的治疗后其
焦虑情况均得到了好转。目前尚没有关于物质成瘾人群服用益生菌后心理状态变化的报导，但结合之前的研究可以得出益生菌可能对于成瘾者心理状态有调节作用的结论。
[0006]此外，将益生菌用于物质成瘾的治疗是物质成瘾研究的趋势。Leclercq等人提出，利用益生菌或益生元调节肠道微生物群是治疗酒精依赖的一种有前途和安全的方法。为了评估益生菌和/或益生元对酒精依赖的影响，尤其是对成瘾的不同行为方面，如抑郁、焦虑、压力反应、认知、冲动和药物寻求行为的影响，肯定需要进行前瞻性、随机、安慰剂对照的临床试验。而甲基苯丙胺成瘾与酒精成瘾的神经学机制类似，都是物质影响了人们的奖惩反应。
[0007]益生菌的施用已显示出作为改善与炎症性肠病(IBD)有关的症状的辅助疗法的功效。根据世界卫生组织的说法，益生菌被定义为“活微生物，当给予适量的微生物时，会对宿主产生健康益处。”这些细菌包括革兰氏阳性杆菌和双歧杆菌，以及一些大肠杆菌菌株，已显示出多种有益作用，例如调节宿主免疫系统，改善上皮屏障功能以及影响肝细胞的平衡。肠道中的各种细菌菌株。
[0008]将益生菌分离的膜泡(MVs)加载到微粒表面形成益生菌模拟物(PBMs)，可克服MVs在胃肠道的稀释效应和降解效应，提高MVs的递送浓度。并证明PBMs具有抗炎作用，且缓解炎症引起的肠道屏障功能丧失，具有进一步发展成为抗炎制剂的潜力。
[0009]益生菌具有广阔的发展前景，但由于它们具有增生能力，因此仍不总是适合用作治疗剂。特别是对于长期使用免疫抑制剂治疗IBD的患者，不建议同时使用益生菌，因为它会导致菌血症和败血症。一项研究报告说，大肠杆菌Nissle1917(通常用作益生菌的一种菌株)具有与其他大肠杆菌中检测到的致病性相同的基因。一旦这些沉默基因被未知触发物激活，它们可能会在患者中引起致病作用，从而大大限制了益生菌的安全性。
[0010]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：益生菌对于长期使用免疫抑制剂治疗IBD的患者，会导致菌血症和败血症；同时大肠杆菌具有与其他大肠杆菌中检测到的致病性相同的基因，一旦这些沉默基因被未知触发物激活，它们可能会在患者中引起致病作用，从而大大限制了益生菌的安全性。
[0011]解决以上问题及缺陷的难度为：由于益生菌存在的增生能力，因此总是不适合用作治理剂，特别是长期使用免疫抑制治疗剂IBD的患者，使用益生菌会导致菌血症和败血症。使用益生菌则需考虑到其增生能力且不能和别的细菌同时使用，而且还需高效快速的将模拟物递送，不影响别的细菌且高效是本技术所解决问题的难度所在。
[0012]解决以上问题及缺陷的意义为：益生菌模拟物制备技术首次将MVs耦连到微粒表面上，这是一种新型的模拟细菌系统，不仅如此，益生菌模拟物在制备过程中也证明了乳杆菌在液体培养中产生大量MV的能力，这对扩大模拟物制备规模提供了便利。在悬浮液中生长的细菌可以用更大的容器培养，例如发酵罐等，这也可以很容易的增加MV的产量。益生菌模拟物的制备发掘除了仿生仿制药的巨大潜力，在未来的研究中可以进一步开发仿生药物的新型治疗剂。

技术实现思路

[0013]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种益生菌模拟物及其制备方法。本专利技术通过制备益生菌模拟物，作为一种抗炎制剂，来改善炎症引起的肠道屏障功能丧失，以此
对甲基苯丙胺产生戒断作用，帮助吸毒人员戒毒。
[0014]本专利技术是这样实现的，一种益生菌模拟物制备方法，所述益生菌模拟物制备方法，包括：
[0015]步骤一，在补充胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养CaCo
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2HTB
‑
37细胞；
[0016]步骤二，在Caco
‑
2 HTB
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种益生菌模拟物制备方法，其特征在于，所述益生菌模拟物制备方法包括：在补充胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养CaCo
‑
2 HTB
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37细胞；进行TEER的测量；根据干酪乳杆菌和植物乳杆菌的选择培养条件，进行细胞培养；进行中压隔离；细菌培养物通过离心去除残留细菌，将含EV的上清液通过聚偏二氟乙烯膜进行过滤；将上清液转移至超速离心管中离心，弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS中；悬浮的沉淀物通过装有Sepharose CL
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2B的SEC柱纯化，收集1mL的级分，通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度；将醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用高纯水洗涤，然后重悬于高纯水中；将MV悬浮液与纯化珠和PBS混合，进行MV包覆微粒的制备。2.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，胎牛血清为Dulbecco改良的Eagle培养基10％，其中培养基中1％非必需氨基酸混合物。3.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，培养CaCo
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2HTB
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37细胞后期管理为：每2
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3天向细胞补充新鲜培养基，一周后，当细胞达到80
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90％汇合时，将其分裂；THP
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1细胞悬浮于RPMI
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1640培养基中；每3
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4天后，将2.5mL细胞悬液转移至10mL培养基中。4.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，在TEER的测量测定之前，将THP
‑
1细胞离心并重新分散在含有佛波醇12
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肉豆蔻酸酯
‑
13
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乙酸酯7.5ng mL的培养基中，并以每孔1
×
10细胞的密度接种到96孔板中；然后允许细胞分化24小时以进行存活力测试，并分化48小时以进行细胞因子测定。5.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，在Caco
‑
2 HTB
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37细胞第30
±
10代时，进行TEER的测量，TEER的测量具体过程为：将第30
±
10代中的Caco
‑
2 HTB
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37细胞以每孔2
×
10细胞的密度播种在Corning Transwell插入物上；然后使细胞在37℃和5％CO下生长11d，每2
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3天更换一次培养基，顶室500μL，基底外侧室1500μL；11
‑
12d后，在每个孔中测量T...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋刚，杜然浩，董伟仲，张雪，赖明航，张华明，文茹，苗伟杰，陈雪莲，董明，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：