抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用。本发明专利技术抗草鱼pIgR的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)

【技术实现步骤摘要】
抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种多克隆抗体的制备方法及其应用，具体讲是一种抗草鱼(Paralichthys olivaceus)多聚免疫球蛋白受体重组蛋白的多克隆抗体制备方法及其应用，属于鱼类分子免疫学


技术介绍

[0002]在哺乳动物中，多聚免疫球蛋白受体pIgR能够与分泌型多聚免疫球蛋白(IgA或IgM)形成复合物，pIgR经蛋白酶裂解切割后为分泌成分，从而形成分泌型免疫球蛋白阻止病毒、细菌、毒素和外来异物对黏膜组织的黏附和入侵。因此，pIgR的有效分泌是IgA或IgM发挥黏膜防御功能的必要条件。
[0003]鱼类虽然是低等脊椎动物，但它仍有与高等脊椎动物类似的较为完善的免疫系统。研究表明硬骨鱼的皮肤及肠道和哺乳动物的肠道采用同样的免疫球蛋白转运系统，即能够通过上皮细胞中的pIgR转运四聚体免疫球蛋白进入黏液而发挥其免疫功能。制备抗草鱼多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，可以为阐明多聚免疫球蛋白受体的结构、来源、功能以及与免疫球蛋白的关系等提供有力工具；另外，鱼类感染某种病原或接种疫苗后，鱼体会产生pIgR与免疫球蛋白复合物即分泌型免疫球蛋白(SIgs)。因此，利用抗草鱼多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，通过检测草鱼黏液中多聚免疫球蛋白受体的产生，可以进行草鱼疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治具有参考价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法；本专利技术的另一个目的是提供一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用。
[0005]本专利技术的目的是由以下技术方案实现的：
[0006]一种所述抗草鱼pIgR的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)
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pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)
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pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。以制备的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3
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4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼pIgR多克隆抗体。
[0007]所述的构建pIgR表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼pIgR基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。
[0008]所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼pIgR蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体。所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼pIgR蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为
27.64kDa的草鱼pIgR蛋白。
[0009]一种所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后pIgR及SIgs免疫应答规律，弄清pIgR表达与SIgs免疫应答关系；转印免疫印迹法检测并分析草鱼血清及黏液中的plgR；用免疫组织化学染色法定位草鱼pIgR在系统及黏膜组织中的分布。
[0010]所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中pIgR(SC)蛋白水平变化。
[0011]所述的转印免疫印迹法是将草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及血清电泳后转移至PVDF膜，多克隆抗体孵育PVDF膜；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液中天然存在的草鱼pIgR。
[0012]所述的免疫组织化学染色法是将多克隆抗体与草鱼黏膜组织石蜡切片反应；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液细胞膜表面的抗原决定簇。
[0013]本专利技术的制备技术路线设计新颖，其通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR，优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔；经筛选得到抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体；所得的多克隆抗体再经间接酶联免疫法和转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。
[0014]抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体能与草鱼pIgR蛋白特异性结合，且效价高。研究表明pIgR在硬骨鱼体内参与了Ig向黏液中的转运，是黏液发挥免疫防御功能的必要条件。除了介导和转运免疫球蛋白进入黏液中外，pIgR还具有非特异性免疫防御功能。具体表现在pIgR能够激发其它免疫因子的合成；pIgR被蛋白酶水解以后，游离的SC能够阻止嗜中性粒细胞的趋化作用从而降低机体的炎症反应，保护上皮细胞；游离的SC分泌片段能够结合细菌从而有效限制细菌对机体的侵染等等。可见pIgR在生物体自身发挥免疫防御功能，尤其是黏膜免疫防御的过程中起到了非常关键的作用，因此抗草鱼pIgR蛋白多克隆抗体的制得为研究草鱼pIgR蛋白的结构、来源、功能及与免疫球蛋白的关系中的应用提供了重要工具，为草鱼pIgR在黏膜免疫防御的过程中起到的作用研究提供了重要的技术手段。
附图说明
[0015]图1为构建的重组质粒pET28a(+)
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pIgR图谱。
[0016]图2为IPTG诱导pIgR重组表达及Ni柱亲和纯化pIgR电泳图。
[0017]图3为本专利技术的抗草鱼pIgR多抗的转印免疫印迹检测结果图。
[0018]图4为本专利技术的多克隆抗体ELISA法检测免疫刺激后草鱼pIgR表达水平变化结果图。
[0019]图5为本专利技术的多克隆抗体转印免疫印迹法检测的结果图。
[0020]图6为本专利技术的抗草鱼pIgR多抗的免疫组织化学的结果图。
[0021]参见图1
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图6：
[0022]图1所示：构建的重组质粒pET28a(+)
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pIgR图谱。
[0023]图2所示：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示IPTG诱导空质粒；2表示IPTG未诱导重组质粒结果；3表示IPTG诱导重组质粒表达结果；4表示Ni柱亲和纯化结果，分子量为27.64kDa。
[0024]图3所示：M是标准分子量蛋白；1表示抗pIgR多抗孵育IPTG未诱导重组质粒结果；2表示抗pIgR多抗孵育IPTG诱导重组质粒结果；3表示His单抗孵育IPTG诱导重组质粒结果分子量为27.64kDa。
[0025]图4所示：A表示草鱼皮肤黏液pIgR的ELISA结果；B表示草鱼鳃黏液pIgR的ELISA结果；C表示草鱼肠黏液pIgR的ELISA结果；D表示草鱼胆汁pIgR的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)
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pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)
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pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。2.权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。3.权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以制备的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3
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4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼pIgR多克隆抗体。4.根据权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的构建pIgR表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼pIgR基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。5.根据权利要求3所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼pIgR蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体。所述的转印免...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国晶，孟庆磊，张金路，杜兴华，成慧中，王志忠，巩俊霞，李壮，张明磊，
申请(专利权)人：山东省淡水渔业研究院山东省淡水渔业监测中心，
类型：发明
国别省市：