用于3D生物打印的含纳米纤维素的生物墨水、其制造和使用方法、以及由此获得的3D生物结构技术

本发明专利技术的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或优选其组合的形式的纳米纤维素；在离子交联剂存在下可离子交联的海藻酸盐；以及水。纳米纤维素‑海藻酸盐生物墨水具有对于基于挤出的生物打印有利的流变、膨胀、和生物相容性特性。通过实验证明了具有人体鼻中隔软骨细胞的纳米纤维素‑海藻酸盐生物墨水使高分辨率的软骨生物打印成为可能。所披露的纳米纤维素已被证明是与细胞存活和增殖相容的；具有模拟促进分化和组织形成的天然细胞外环境的纳米尺度和微米尺度构造；并且具有理想的流变特性以允许挤出3D生物打印。具有晶体和原纤维纳米纤维素的独特共混物的生物墨水在培养中产生非常稳定的结构体积。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于3D生物打印的含纳米纤维素的生物墨水、其制造和使用方法、以及由此获得的3D生物结构优先权数据本国际专利申请要求于2018年3月7日提交的美国临时专利申请号62/639,538的优先权，将所述专利申请特此通过援引并入本文。
本专利技术总体上涉及3D生物打印、用于3D生物打印的生物墨水组合物、生物墨水组合物的制造和使用方法、以及由3D生物打印生产的3D生物结构。
技术介绍
三维(3D)打印，或增材制造是一种工艺，通过该工艺使用专用打印机将物体以其三维形式创建出来。在3D建模程序的帮助下，打印机接收来自计算机中创建的设计文件的指令。然后将待打印的物体的文件或数据蓝图切分成被送到打印机的二维(2D)表示。根据文件中含有的信息建立材料的多个层；这些层持续增加，直到打印出完整的物体。与2D打印相比，3D打印的工艺需要更长的时间，并且涉及大量的资本投资，但是提供了广泛的优势，如原则上打印出任何几何结构的能力。现在在工业和学术界对使用3D打印技术构建组织和器官存在强烈的兴趣。使用3D打印技术打印活细胞、组织、器官和生物相容的支架的工艺被称作“3D生物打印”。生物打印人体组织和器官需要生物墨水，该生物墨水包括生物材料，如琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、胶原蛋白、细胞外基质(ECM)、明胶、纤维蛋白、和透明质酸。生物材料的3D打印提供了许多优势。这些应用主要是在药物检测、组织工程、和器官移植的领域，但其他生物应用可能会在未来出现。因为3D生物打印涉及功能性活生物材料，所以3D生物打印比聚合物或金属的常规3D打印复杂得多。由于活细胞和组织的不同敏感性所形成的挑战，所使用的材料、细胞类型、以及生长和分化因子的适当选择通常决定生物打印的组织的结构完整性。因为基于挤出和喷墨的技术改编自常规3D打印工艺，所以存在将这些体系与脆弱的生物材料一起使用有关的若干相容性和稳定性问题。使用上述技术开发的生物打印的产品在微观水平上缺少结构完整性。值得注意的是，在多个长度尺度上的细胞结构影响整个人造组织的功能性；这对于完全功能组织的产生是至关重要的。希望生物墨水同时复制天然组织微观构造和宏观构造，克服常规组织工程策略的可重复性和可缩放性问题。关于3D生物打印的另一个常见观察结果是，构建的3D生物结构很大程度上是不稳定的，并且曾被报道随时间推移经历形状畸变。在三种主要的3D生物打印技术：挤出、喷墨和激光辅助中，挤出是最通用、快速、可缩放且成本有效的，并且因此是现今的主要技术。挤出生物打印依赖于使用机械力(活塞或螺杆驱动)或气动力通过喷嘴挤出具有合适的机械特性(粘度、弹性、和剪切稀化)的生物墨水。基于挤出的生物打印(例如，生物绘制(bioplotting)或熔融沉积建模)涉及通过喷嘴或注射器分配粘性生物墨水。打印后，构建物可以逐层以物理方式或以化学方式固化(例如，凝胶化)。基于挤出的生物打印的主要缺点之一是其对于最佳材料粘度的依赖，当没有实现时，这可能导致泄漏并且影响最终的组织构建物的分辨率，这限制了生物结构(尤其具有突出部分的那些生物结构)的复杂性。合适的生物墨水必须还展现出在剪切和/或高温下的细胞活力、粘附、增殖和分化。而且，合适的生物墨水应该能够产生具有可接受的机械刚度的生物结构。尽管更容易定制合成聚合物生物墨水如聚丙烯酰胺和聚乙二醇的生物力学特性以适合挤出技术，但是这些聚合物的生物相容性和组织再生潜力比不上模拟天然的细胞外基质环境的天然的非合成的生物墨水如明胶、琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸和胶原蛋白。因此，挤出3D生物打印的主要挑战之一是确定具有合适的流变特性以及生物相容性的非合成生物墨水。许多聚合物提供合适的流变特性但不是生物相容的。在另一方面，许多生物材料是生物相容的，但不赋予生物墨水合适的流变特性，以使其可用于生物打印。保证生物打印的构建物的高分辨率或保真度并找到最佳生物墨水仍是打印复杂生物结构的主要障碍。较高的分辨率不仅允许更好地复制天然构造，而且还可以控制孔径和相互连接性，当考虑到在400-500mm内的扩散距离可能限制氧气传输并且因此限制细胞活力时，这是重要的。目前，立体平板印刷和基于喷墨的技术提供了良好的分辨率，但是受到缺少适当的生物材料、降低的细胞活性和差机械强度的限制。激光辅助生物打印机可以以微尺度分辨率打印，但制备用于沉积的单独的带状物可能是耗时的且不是成本有效的。对于附加的背景信息，参见Jessop等人，“3Dbioprintingforreconstructivesurgery:Principles,applicationsandchallenges[用于重建外科的3D生物打印：原理、应用和挑战]”,JournalofPlastic,Reconstructive&AestheticSurgery[整形、重建和美容外科期刊](2017)70,1155-1170，将该文献特此通过援引并入。组织工程承诺创建将每年拯救成千上万生命并减轻长期健康负担的实体器官移植。此外，组织工程有潜力为天生具有先天性畸形的患者或后来在生活中由于创伤或恶性肿瘤而患有畸形的患者恢复形态和功能。软骨是具有有限的自再生特性的含有软骨细胞的无血管组织。因为软骨不会自我修复，所以对于用可替代的途径如组织工程替换受损的软骨组织存在需求。来自创伤、烧伤、皮肤癌、或先天性疾病的面部软骨缺陷的重建目前依赖于使用自体移植，最常见从肋骨软骨部位进行自体移植，伴随显著的供体部位发病率。尤其当使用合成生物材料时，基于支架的非特异性细胞接种的组织工程的软骨构建物不能复制天然组织各向异性，并且因此在机械上不稳定且易于在体内降解、钙化、和发炎。对软骨的3D生物打印进行的当代研究已确定了几种潜在的天然生物墨水材料，包括纤维蛋白、海藻酸盐、明胶、由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白质混合物、以及纳米纤维素，这些天然生物墨水材料已经被用作用于促进细胞从邻近的健康组织归巢或在加入细胞组分如软骨细胞或间充质干细胞后沉积细胞外基质的支架。然而，由于不最理想的可打印性，更通常使用的生物墨水的应用可能是个挑战。特别地，纯的海藻酸盐配制品以被确定为即使当增加粘度时也提供差的打印后形状保真度。由平行的线性多糖分子构成并从植物或细菌的生物合成提取的纳米纤维素是新兴种类的先进的天然衍生的纳米材料。由于其有吸引力的物理化学特性、极其高的刚度(100-200GPa)和强度以及其充足性和可持续性，纳米纤维素是有前途的。由于其生物相容性、纳米结构、功能化潜能、持水能力、以及在形态上与胶原蛋白的相似性，细菌纳米纤维素已显示出用于组织工程应用的希望，由此提供细胞支持。由于细菌纤维素的高纵横比，独特的生物力学和流变特性还意味着它具有作为生物墨水用于3D生物打印的潜在效用。然而，用于生产细菌纳米纤维素的当前技术受到支持细菌生长的巨大基质成本、产品的低产率、可缩放性以及关于已被禁止广泛使用的剩余细菌毒素/表位的忧虑的限制。纳米纤维素还可以使用昂贵的酶促处理或使用具有差的化学回收的浓酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：/n(a)呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合形式的纳米纤维素；/n(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及/n(c)水，/n其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180307 US 62/639,5381.一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：
(a)呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合形式的纳米纤维素；
(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及
(c)水，
其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。


2.一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：
(a)呈纳米纤维素原纤维形式的纳米纤维素，其中所述纳米纤维素的特征在于至少240℃的热分解起始温度；
(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及
(c)水，
其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。


3.一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：
(a)呈纳米纤维素晶体形式的纳米纤维素，其中所述纳米纤维素的特征在于至少290℃的热分解起始温度；
(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及
(c)水，
其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。


4.如权利要求1至3中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在。


5.如权利要求4所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素以从3％(w/v)至6％(w/v)的纳米纤维素浓度存在。


6.如权利要求1至5中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在。


7.如权利要求1至6中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物是不含细胞的生物墨水。


8.如权利要求1至6中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物是含有活的人体细胞的负载细胞的生物墨水，并且其中所述活的人体细胞任选是人体鼻中隔软骨细胞。


9.如权利要求8所述的生物墨水组合物，其中，所述活的人体细胞以每毫升所述生物墨水组合物从105至107个细胞的细胞浓度存在于所述生物墨水组合物中。


10.如权利要求1至9中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素是亲水性纳米纤维素。


11.如权利要求1所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素的特征在于至少250℃的热分解起始温度。


12.如权利要求11所述的生物墨水组合物，其中，所述热分解起始温度是至少290℃。


13.如权利要求2所述的生物墨水组合物，其中，所述热分解起始温度是至少270℃。


14.如权利要求3所述的生物墨水组合物，其中，所述热分解起始温度是至少310℃。


15.如权利要求1至14中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素含有小于0.05wt％的硫。


16.如权利要求1至15中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素不含硫酸半酯基团。


17.如权利要求1至16中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素具有至少-20mV或更负的ζ电位。


18.如权利要求1至17中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素是剪切稀化的。


19.如权利要求1至18中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将所述纤维素机械精制以产生所述纳米纤维素。


20.如权利要求1至19中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素不是细菌纳米纤维素，其中所述纳米纤维素不来源于被囊动物，并且其中所述纳米纤维素不经由木质纤维素生物质或纤维素的酶促水解获得。


21.如权利要求1至20中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物进一步包含离子交联剂。


22.如权利要求21所述的生物墨水组合物，其中，所述离子交联剂包括二价阳离子。


23.如权利要求22所述的生物墨水组合物，其中，所述二价阳离子选自下组，该组由以下各项组成：Ca2+、Sr2+、Ba2+、及其组合。


24.如权利要求1至23中任一项所述的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物进一步包含选自下组的一种或多种生物墨水添加剂，该组由以下各项组成：生长促进剂、生长因子、维生素、矿物质、酶、蛋白质、糖、糖醇、酸、碱、盐、缓冲剂、稳定剂、溶解氧、以及抗生素。


25.如权利要求1至24中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物对人体细胞是非细胞毒性的。


26.一种制造用于3D生物打印的生物墨水组合物的方法，所述方法包括：
(a)获得呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中所述纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中所述纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；
(b)将所述纳米纤维素与海藻酸盐在水溶液中组合，其中所述海藻酸盐呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐的形式，并且其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的；
(c)将所述水溶液灭菌，或者在制备所述水溶液之前分别将所述纳米纤维素和所述海藻酸盐灭菌；
(d)任选将多种活的人体细胞加入所述水溶液；以及
(e)将所述水溶液回收作为用于3D生物打印的生物墨水组合物。

【专利技术属性】
技术研发人员：金伯利·纳尔逊，伊恩·惠特克，齐塔·杰索普，艾莎·阿尔萨巴，
申请(专利权)人：格兰生物科技知识产权控股有限责任公司，再生素有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US