一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法技术

本发明专利技术提供一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法，软骨修复材料包括生物基质和固化液，其中，生物基质包括胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白，混合制成溶液或冻干粉形式进行使用；固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液；使用时，既可以将生物基质和固化液混合后直接填充到软骨缺损处，也可以在体外预先固化成型，做成软骨重建生物支架，再用于软骨贴补。使用时，还可以包括软骨细胞或干细胞，从而进一步提高软骨修复材料的分化能力。本发明专利技术的有益效果是：能够有效填充软骨上的缺损，保证机械强度的同时还具有软骨传导和诱导能力；另外软骨修复材料能够保持被移植的软骨细胞在缺损位置上有长久保留并保持分化能力，促进其再生。

【技术实现步骤摘要】
一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法
本专利技术属于组织工程及再生医学领域，尤其是涉及一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法。
技术介绍
运动医学是一门新兴的综合性应用学科，主要涉及膝，肩，踝，肘等关节损伤和骨关节病。特别是关节软骨损伤，是一种普遍的，对病人造成很大痛苦的病症。骨头和软骨的损伤是关节炎的发病机理，并且是外伤伤势和内假肢松动方面的重要因素。此类疾病可以通过自体组织或者同源异体材料及可替代的材料进行相应的治疗。自体材料及同源异体材料受到材料来源及感染的风险无法规模化应用及医学转化，因此可替代材料成为了行业发展的趋势。如在硬骨成型及再造方面美国Medtronic，Inc公司的INFUSEBoneGraft、华东医药集团的“骨诱导”等产品都做了较大的贡献。同时专利CN106421901A公布一种可注射兼具缓释性能的骨修复生物活性材料及其制备方法，弥补了硬骨再造方面可注射修复的缺损。在软骨重建方面，利用同体的软骨移植(ACT)技术对软骨损伤进行治疗的方法，首次证实在损伤的关节软骨中有透明软骨的再生。但是受限于自体软骨细胞培养时间较长，及操作难度较大等问题，仅限于实验室研究，无法应用于临床。同时在软骨可替代材料方面，诸如由聚-D-丙交酯，多聚-L-丙交酯，多聚-D、L-丙交酯，羟磷灰石，磷酸钙形成的可替代材料；由I、II型胶原蛋白形成的纳米微球型软骨修复材料；由胶原蛋白形成的三维网络支架等新型材料在软骨修复及重建的过程中都做了一定的贡献。但是以上的材料，都存在着以下几个方面的问题。首先，可替代的材料或支架缺乏软骨的传导及诱导能力，缺乏一定的机械强度；同时，作为支架材料，被移植或者培养的软骨细胞无法重新达到其原来的合成性，能即软骨细胞(P0)会在体外的培养条件下去分化，从而丢失胶原蛋白的合成性能。在迄今为止的方法中，用于培养软骨细胞的已知的三维结构无法专门适应每一种软骨缺损。此外，也无法保证被移植的软骨细胞在缺损的位置上长久并且保持分化能力，从而使软骨再生。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法。本专利技术采用的技术方案是：一种软骨修复材料，包括生物基质和固化液，生物基质由胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白组成；固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液。优选地，还包括软骨细胞或干细胞。优选地，胶原蛋白为I型胶原蛋白，I型胶原蛋白为鼠尾胶原、牛跟腱胶原或重组人胶原蛋白，I型胶原蛋白浓度为2-10mg/mL，优选为4-8mg/mL，进一步优选为6mg-7mg/mL。优选地，I型胶原蛋白为鼠尾胶原，制备方法如下：取鼠尾表皮杀菌处理，取鼠尾中间段尾腱，并去除尾腱上多余的多糖及脂肪得到预处理尾腱；向预处理尾腱中加入预冷醋酸，再加入胃蛋白酶，低温震荡反应至溶液澄清透明，离心取上清；向上清液中加入氯化钠析出并收集蛋白沉淀，再通过透析纯化沉淀物得到鼠尾胶原；优选地，按照投料比为1:10-100向预处理尾腱中加入0.01-0.1M预冷醋酸；优选地，胃蛋白酶添加量为体积比0.5-5％；优选地，收集蛋白沉淀具体为：向上清液中加入2M氯化钠，沉淀2-8h，离心去上清后向沉淀物中再次加入0.01-0.1M预冷醋酸重悬溶解，再重复加入2M氯化钠析出并重新收集蛋白沉淀；优选地，采用30-50KDa透析膜。优选地，纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白或猪血纤连蛋白，含量为100-1000ug/mL。优选地，纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白，序列如SEQNO：1所示。优选地，软骨形态发生蛋白为软骨组织提取物或重组人软骨源性形态发生蛋白，重组人软骨源性形态发生蛋白为CDMP1或CDMP2，含量为10-200ng/mL，优选为80-120ng/mL。优选地，软骨形态发生蛋白为重组人软骨源性形态发生蛋白CDMP1，序列如SEQNO：2所示。优选地，固化液为由50-80％的2×DMEM培养基、10-30％的血清、1-5％的10-50mM的Hepes缓冲液组成的溶液；优选地，固化液为由75-80％的2×DMEM培养基、15-25％的血清、2-4％的20-30mM的Hepes缓冲液组成的溶液，其中血清进一步优选为20％，Hepes缓冲液进一步优选为3％。由软骨修复材料体外构建软骨重建生物支架的方法，向固化液中按照1:1体积比添加生物基质，混匀后转入模具固化培养，修剪后形成能够用于软骨损伤修复的软骨重建生物支架；或，混匀后作为3D打印生物墨水，根据损伤三维结构3D打印得到软骨重建生物支架。优选地，预先使用固化液重悬软骨细胞或干细胞，细胞浓度为2×105/mL，再加入生物基质。使用软骨重建生物支架构建方法构建得到的软骨重建生物支架在软骨修复中的应用，将软骨重建生物支架通过生物胶贴敷于软骨损伤区，优选地，生物胶为纤维蛋白连接胶。包括软骨修复材料的注射型软骨修复材料，隔离储存生物基质和固化液，使用前混合并填充到软骨损伤处。软骨修复材料在美容整形中面部和胸部的修补材料中的应用。本专利技术具有的优点和积极效果是：使用本专利技术所涉及的软骨修复材料，使得医生能够更好的处理软骨疾病，尤其针对软骨缺损，能够有效填充软骨上的缺损，保证机械强度的同时还具有软骨传导和诱导能力；另外本专利技术所涉及的软骨修复材料能够保持被移植的软骨细胞在缺损位置上有长久保留并保持分化能力，促进其再生；由软骨修复材料制得的软骨生物修复支架，可以解决待移植细胞的去分化的问题，去分化的移植细胞在本专利技术的支架中进行预培养仍然具备再分化及代谢功能。具体实施方式本专利技术涉及一种软骨修复材料，包括生物基质和固化液，其中，生物基质包括胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白，混合制成溶液或冻干粉形式进行使用；固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液。使用时，既可以将生物基质和固化液混合后直接填充到软骨缺损处，也可以在体外预先固化成型，做成软骨重建生物支架，再用于软骨贴补。使用时，还可以包括软骨细胞或干细胞，从而进一步提高软骨修复材料的分化能力。本专利技术的工作机理为，利用胶原蛋白配合固化液形成三维骨架结构，填充于软骨缺损处，或通过移植的软骨细胞重建软骨，通过纤维连接蛋白及软骨形态发生蛋白诱导、迁移、分化软骨细胞或干细胞爬行实现软骨修复。本专利技术某些实施例中，胶原蛋白为I型胶原蛋白，I型胶原蛋白为鼠尾胶原、牛跟腱胶原或重组人胶原蛋白，I型胶原蛋白浓度为2-10mg/mL，优选为4-8mg/mL，进一步优选为6mg-7mg/mL。鼠尾胶原、牛跟腱胶原以及重组人胶原蛋白均可选用现有已知生物材料。本专利技术某些实施例中，I型胶原蛋白采用鼠尾胶原时，因其胶原蛋白的三螺旋结构及生物功能，其机械性能更佳。为了提高鼠尾胶原的收率和纯度，本专利技术可采用醋酸和胃蛋白酶同时处理鼠尾制备鼠尾胶原，先取鼠尾表皮杀菌处理，取鼠尾中间段尾腱，并去除尾腱上多余本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种软骨修复材料，其特征在于：包括生物基质和固化液，/n生物基质由胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白组成；/n固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液。/n

【技术特征摘要】
1.一种软骨修复材料，其特征在于：包括生物基质和固化液，
生物基质由胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白组成；
固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液。


2.根据权利要求1所述的软骨修复材料，其特征在于：还包括软骨细胞或干细胞。


3.根据权利要求1或2所述的软骨修复材料，其特征在于：所述胶原蛋白为I型胶原蛋白，所述I型胶原蛋白为鼠尾胶原、牛跟腱胶原或重组人胶原蛋白，所述I型胶原蛋白浓度为2-10mg/mL，优选为4-8mg/mL，进一步优选为6mg-7mg/mL；优选地，所述I型胶原蛋白为鼠尾胶原，制备方法如下：
取鼠尾表皮杀菌处理，取鼠尾中间段尾腱，并去除尾腱上多余的多糖及脂肪得到预处理尾腱；
向预处理尾腱中加入预冷醋酸，再加入胃蛋白酶，低温震荡反应至溶液澄清透明，离心取上清；
向上清液中加入氯化钠析出并收集蛋白沉淀，再通过透析纯化沉淀物得到鼠尾胶原；
优选地，按照投料比为1:10-100向预处理尾腱中加入0.01-0.1M预冷醋酸；
优选地，胃蛋白酶添加量为体积比0.5-5％；
优选地，收集蛋白沉淀具体为：向上清液中加入2M氯化钠，沉淀2-8h，离心去上清后向沉淀物中再次加入0.01-0.1M预冷醋酸重悬溶解，再重复加入2M氯化钠析出并重新收集蛋白沉淀；
优选地，采用30-50KDa透析膜。


4.根据权利要求1或2所述的软骨修复材料，其特征在于：所述纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白或猪血纤连蛋白，含量为100-1000ug/mL。
优选地，所述纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白，序列如SEQNO：1所示。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，
申请(专利权)人：亘元天津生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12