一种禽大肠杆菌活疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种禽大肠杆菌活疫苗，是在筛选获得了一种新型的禽致病性大肠杆菌O78的基础上，通过去除aroA基因制备的弱毒株，使用该弱毒株来制备疫苗；该弱毒株保持了流行毒株大肠杆菌O78株所具备的天然的免疫原性，同时毒性明显致弱。本发明专利技术所提供的禽大肠杆菌活疫苗，包含有抗原和佐剂，其中抗原是活的YBO78‑1株，其保藏编号为CCTCC M 2020383。本发明专利技术所提供的疫苗还用于制备用于防治家禽的制品；所述的家禽包括鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡、鹌鹑、野鸡、鸽子等。本发明专利技术所提供的大肠杆菌疫苗可以通过传统的方法进行使用，比如通过经济易操作的喷雾和饮用水进行大规模的施用，也可以通过肌肉注射或其他的方式进行施用。

【技术实现步骤摘要】
一种禽大肠杆菌活疫苗
本专利技术属于兽医生物制品
，具体涉及一种禽大肠杆菌活疫苗。
技术介绍
禽大肠杆菌病是一种经济上重要的传染病家禽疾病，病原是禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenicEscherichiacoli,APEC)。APEC通常存在于家禽和野生鸟类肠道和其他黏膜的表面，包含有O1、O2、O78、O8和O35等血清型，其中O78血清型是临床分离中最常见的血清型。家禽中大肠杆菌感染最严重的表现是败血病，通常始于原发性支原体或病毒感染后的上呼吸道感染，导致渗入血液和内脏，最终引起心包炎、肝炎、空气囊炎和输卵管炎等疾病。禽大肠杆菌病发病时间快、死亡率高，目前养殖业中主要使用抗生素治疗细菌感染性疾病。但是在动物机体中长期使用低于治疗剂量的抗生素能大大加速耐药细菌的出现，如果耐药菌一旦在养殖动物中大范围传播，将使养殖动物成为很大的耐药基因储藏库。因此通过疫苗来预防，利用非抗生素方法防控APEC将是未来发展的必然趋势，其中接种疫苗是有效防控禽大肠杆菌病发生和流行、减少禽产品污染及保证食品安全的重要途径。但是目前大肠杆菌疫苗多为灭活疫苗，制备成油乳剂疫苗和氢氧化铝胶疫苗，油乳疫苗副反应大，氢氧化铝胶疫苗免疫效果差，在市场中大肠杆菌灭活疫苗的使用效果均不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种禽大肠杆菌活疫苗，是在筛选获得了一种新型的禽致病性大肠杆菌O78的基础上，通过去除aroA基因制备的弱毒株，使用该弱毒株来制备疫苗；该弱毒株保持了流行毒株大肠杆菌O78株所具备的天然的免疫原性，同时毒性明显致弱，从而弥补现有技术的不足。本专利技术所提供的禽大肠杆菌活疫苗，包含有抗原和佐剂，其中抗原是活的YBO78-1株，其保藏编号为CCTCCM2020383的禽致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)；所述的禽致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)YBO78-1株，是将保藏编号为CCTCCM2020382的禽致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)YBO78株的aroA基因进行缺失后制备的；所述的YBO78-1株是通过Red/ET同源重组系统，将YBO78株的aroA基因缺失制备的。所述的疫苗佐剂，为水性疫苗佐剂。本专利技术所提供的疫苗还用于制备用于防治家禽的制品；所述的家禽包括鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡、鹌鹑、野鸡、鸽子等，优选的是商业上重要的家禽例如鸡、鸭、鹅、火鸡，更优选的是鸡和火鸡，特别优选的是鸡。本专利技术所提供的大肠杆菌疫苗可以通过传统的方法进行使用，比如通过经济易操作的喷雾和饮用水进行大规模的施用，也可以通过肌肉注射或其他的方式进行施用。附图说明图1：PCR鉴定大肠杆菌O78和O78aroA基因敲除株图。具体实施方式本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如AnewlogicforDNAengineeringusingrecombinationinEscherichiacoli(zhangetal.,Naturegenetics1998)，RapidmodificationofbacterialartificialchromosomesbyET-recombination(Muyrersetal.,Nucleicacidsresearch1993)中所记载的方法。细菌的aroA基因编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的合成，该酶对于细菌芳香族氨基酸等芳香族化合物的合成代谢具有十分重要的意义，该基因缺失后会阻断细菌体内的芳香族生物合成途径。Red/ET同源重组技术来源于lamda噬菌体，可以用于大肠杆菌基因组的基因敲除、插入、点突变等，利用Red/ET同源重组技术构建致病性大肠杆菌aroA基因缺失株，在其生物学特性和致病力基础上评估该基因缺失菌株作为疫苗候选株的潜力。本专利技术所提供的禽大肠杆菌YBO78是从青岛某大型鸡场大肠杆菌发病鸡器官组织中筛选培养获得的一株强毒株；YBO78-1是通过Red/ET同源重组系统得到的O78株aroA基因缺失株，导致毒力减弱，使用该菌来制备活疫苗，从而对鸡提供更完善的免疫保护。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：菌株的分离纯化及理化性质分析1)2018年6月山东某个鸡养殖场发生了严重的大肠杆菌疫情，通过采集病死鸡的器官心脏、肝脏、脾脏等，置于采样袋中密封，带回实验室置于4℃冰盒保存备用。2)把收集的鸡器官研磨后涂在显色培养基上，显示不同颜色的菌株，每3个显示不同颜色的菌株作为一组接种到LB液体培养基进行扩大培养，10000rpm离心收集菌体，然后把菌体用0.5％无菌的PBS重悬，用比浊法将菌株的细菌浓度定为1×107CFU/ml。3)强毒分离实验：将分离得到的菌株分别在普通肉汤培养基中37培养24h，分别按菌数1.0x106/ml配成菌液，把40只1日龄的鸡随机分成4组，每组10只，每组鸡腹腔注射一种血清型菌株的菌液0.2ml/只，对照组注射0.2ml/只普通肉汤，接种后隔离器中观察72h，记录鸡的死亡数并从其肝和脾中分离细菌，然后把存活的鸡解剖观察病变情况(表1)。表1：大肠杆菌O1、O2、O78攻击1日龄鸡实验表药物名称O1O2O78死亡数7810存活数3204)使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的DNA，利用16SrRNA细菌鉴定的通用引物1492F(5-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3)和27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3)进行高保真PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收后切取目的条带、产物送到上海生工生物有限公司测序，并对测序结果进行NCBIblast分析，其中16SrRNA序列如下(SEQIDNO:1)：TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAAGCTTGCTTCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGCATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCTGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽大肠杆菌活疫苗，其特征在于，所述的禽大肠杆菌活疫苗包含有抗原和佐剂，其中抗原是活的YBO78-1株，其保藏编号为CCTCC M 2020383。/n

【技术特征摘要】
1.一种禽大肠杆菌活疫苗，其特征在于，所述的禽大肠杆菌活疫苗包含有抗原和佐剂，其中抗原是活的YBO78-1株，其保藏编号为CCTCCM2020383。


2.如权利要求1所述的禽大肠杆菌活疫苗，其特征在于，所述的YBO78-1株是将保藏编号为CCTCCM2020382的禽致病性大肠杆菌YBO78株的aroA基因进行缺失后制备的。


3.如权利要求2所述的禽大肠杆菌活疫苗，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振，楚电峰，孙化露，孙鹏，侯玉超，于晓璐，张友明，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37