一种金线莲多倍体诱导方法技术

本发明专利技术提供一种金线莲多倍体诱导方法，采用诱导剂准备，茎段预培养处理、诱导剂浸泡处理、筛选培养等步骤。本发明专利技术使得染色体加倍诱导效率更高，有效改良了秋水仙素诱导导致的外植体低成活率现象，低浓度诱导剂的使用不仅可以使植株更加健康高效的生长，也可以降低对操作人员的身体伤害。

【技术实现步骤摘要】
一种金线莲多倍体诱导方法
本专利技术涉及园艺植物繁殖与新品种培育领域，特别涉及一种金线莲多倍体诱导方法。
技术介绍
金线莲的新品种获取多是直接取于户外野生株系，外植体消毒后进行组培苗的增殖扩繁。通过杂交获取新品种的方式较少。在金线莲的多倍体育种中，多采用秋水仙素进行诱导使植株染色体加倍，从而获取多倍体植株。如0.1%秋水仙素溶液浸泡处理金线莲茎段48h，其诱变率可达48%。活体条件下用一定浓度的氨磺灵（Oryzalin）诱导加倍，主要采用浸渍、滴液、涂抹、套罩、注射或毛细管法等处理。离体条件下用Oryzalin诱导加倍，主要采用浸泡或包埋法。已经在毛新杨、百合、苹果、大蒜、烟草、大丁草、单倍体苹果、单倍体洋葱、单倍体梨、百合等植物上进行了尝试，并获得成功加倍。在金线莲上还未进行试验。目前金线莲杂交育种的研究很少，金线莲不同品种间存在着较明显的杂交不亲和问题，且种荚多为败育，自然条件下种子的萌发率与成活率低，很难得到杂交后代，更难获得多倍体植株。通过人工诱导多倍体，大多是用化学诱导法，秋水仙碱是目前应用较多的染色体加倍试剂。秋水仙碱应用虽然广泛，但是其与植物微管蛋白作用时亲和力较低、不易作用于分生组织细胞，且清除困难，会导致被处理的植物材料容易被毒害、危害实验操作人员。此外，植物材料上残留的秋水仙碱可能导致产生额外染色体加倍，被加倍的细胞可以被重复加倍，这就会引起含有不同倍数水平的染色体的植株出现。Oryzalin是一种抗微管物质，能与植物微管蛋白高度亲和形成Oryzalin－微管蛋白复合体，并干扰细胞器的Ca2+运输系统，导致更多微管解聚合，抑制细胞有丝分裂，达到低浓度、高效率诱导细胞染色体加倍的效果。与秋水仙素相比较，Oryzalin具有低浓度、低毒性、低成本、高效率诱导染色体加倍等特点。目前利用Oryzalin诱导多倍体这一技术已成功地应用于多种药用植物的育种，获得了许多新的种质资源，而有关Oryzalin诱导金线莲多倍体的研究国内外尚未见报道。采用组织培养技术和Oryzalin诱导处理相结合方法，开展在离体培养的条件下诱导金线莲多倍体的研究，以期探索一条经济、简便、有效的多倍体金线莲诱导途径，为金线莲的良种培育奠定技术基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种金线莲多倍体诱导方法。解决目前金线莲杂交育种的研究很少，金线莲不同品种间存在着较明显的杂交不亲和问题，且种荚多为败育，自然条件下种子的萌发率与成活率低，很难得到杂交后代，更难获得多倍体植株等问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：（1）诱导剂准备：先将20mg氨磺灵粉末溶于1mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制浓度为2%的母液，用纯净水稀释浓度为0.002%的氨磺灵溶液，冻融灭菌处理后密封于4摄氏度冰箱保存。（2）茎段预培养处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在超净工作台中切成3-4cm的带有多个芽点的茎段，接入MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.5mg/LKT+0.5g/LAC+30g/L蔗糖的培养基中，预培养2-3天，至茎段的侧芽部位出现肉眼可见白色芽点。（3）诱导剂浸泡处理：将已长出芽的长茎段浸泡于0.002%氨磺灵溶液中，置于23摄氏度、12小时光照条件下，浸泡处理108h，每6小时摇晃一次，使材料与药液充分接触。浸泡结束后，用无菌水冲洗茎段3-5次，切成1-1.5cm带单个芽的小段，接入增殖培养基MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5g/LAC+30g/L蔗糖上，在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下进行培养。以上操作均在无菌条件下进行。（4）筛选培养：为保证其变异的稳定性，将已经增殖培养6个月的诱导小苗进行扩繁，接入增殖培养基MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5g/LAC+30g/L蔗糖上，在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下进行培养，培养9个月后对其进行筛选和鉴定。本专利技术的优点在于：1.开发了一种更经济实惠的多倍体诱导技术。2.使得染色体加倍诱导效率更高。3.有效改良了秋水仙素诱导导致的外植体低成活率现象。4.低浓度诱导剂的使用不仅可以使植株更加健康高效的生长，也可以降低对操作人员的身体伤害。附图说明图1：2倍体培养75d。图2：多倍体培养75d。图3：2倍体培养6个月。图4：多倍体培养6个月。图5：2倍体扩繁后培养9个月。图6：多倍体扩繁后培养9个月。图7：2、多倍体扩繁后培养9个月对比。图8：2倍体植株气孔和保卫细胞。图9：多倍体植株气孔和保卫细胞。图10：2倍体植株气孔数。图11：多倍体植株气孔数。图12：2倍体植株染色体。图13：多倍体植株染色体。具体实施方式实施例1（1）诱导剂准备：先将20mg氨磺灵粉末溶于1mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制浓度为2%的母液，用纯净水稀释浓度为0.002%的氨磺灵溶液，冻融灭菌处理后密封于4摄氏度冰箱保存。（2）茎段预培养处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在超净工作台中切成3-4cm的带有多个芽点的茎段，接入MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.5mg/LKT+0.5g/LAC+30g/L蔗糖的培养基中，预培养3天，至茎段的侧芽部位出现肉眼可见白色芽点。成活率达到72%。（3）诱导剂浸泡处理：将已长出芽的长茎段浸泡于0.002%氨磺灵溶液中，置于23摄氏度、12小时光照条件下，浸泡处理108h，每6小时摇晃一次，使材料与药液充分接触。浸泡结束后，用无菌水冲洗茎段5次，切成1-1.5cm带单个芽的小段，接入增殖培养基MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5g/LAC+30g/L蔗糖上，在温度23±2℃、光照强度2500lx、光照时间12h/d条件下进行培养。以上操作均在无菌条件下进行。（4）筛选培养：为保证其变异的稳定性，将已经增殖培养6个月的诱导小苗进行扩繁，接入增殖培养基MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5g/LAC+30g/L蔗糖上，在温度23±2℃、光照强度2500lx、光照时间12h/d条件下进行培养，培养9个月后，初步对诱导植株的株高、茎粗、叶长、叶宽进行测量观察，在此基础上再对诱导植株和原二倍体进行植株叶片气孔大小、气孔数量、根尖染色体数量的对比，来进行鉴定，鉴定结果如下。由表1、图5-7可见，诱导植株与原二倍体植株相比，其叶长、叶宽分别增加了49.21%和43.16%，株高增加了111.01%，茎粗增加了63.93%，在形态特征方面可以明显看出诱导植株的巨型性特征；在气孔器鉴定方面，由表2、图8-11可以看出，诱导植株与原二倍体植株相比，其气孔形态增大，密度减少；在形态学鉴定和气孔鉴定的基础上，通过对比诱导植株与原二倍体植株茎尖细胞的染本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金线莲多倍体诱导方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/n（1）诱导剂准备：先将20 mg氨磺灵粉末溶于1 mL二甲基亚砜中，配制浓度为2% 的母液，用纯净水稀释浓度为0.002% 的氨磺灵溶液，冻融灭菌处理后密封于4摄氏度冰箱保存；/n（2）茎段预培养处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在超净工作台中切成3-4cm的带有多个芽点的茎段，接入MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+0.5g/L AC+30g/L 蔗糖的培养基中，预培养2-3天，至茎段的侧芽部位出现肉眼可见白色芽点；/n（3）诱导剂浸泡处理：将已长出芽的长茎段浸泡于0.002% 氨磺灵溶液中，置于23摄氏度、12小时光照条件下，浸泡处理108h，每6小时摇晃一次，使材料与药液充分接触；浸泡结束后，用无菌水冲洗茎段3-5次，切成1-1.5cm带单个芽的小段，接入增殖培养基 MS+ 2mg/L6-BA+ 0.5mg/L NAA+0.5g/L AC + 30g/L 蔗糖上在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下进行培养，以上操作均在无菌条件下进行；/n（4）筛选培养：为保证其变异的稳定性，将已经增殖培养6个月的诱导小苗进行扩繁，接入增殖培养基 MS+ 2mg/L 6-BA+ 0.5mg/L NAA+0.5g/L AC + 30g/L 蔗糖上在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下进行培养，培养9个月后对其进行筛选和鉴定。/n...

【技术特征摘要】
1.一种金线莲多倍体诱导方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）诱导剂准备：先将20mg氨磺灵粉末溶于1mL二甲基亚砜中，配制浓度为2%的母液，用纯净水稀释浓度为0.002%的氨磺灵溶液，冻融灭菌处理后密封于4摄氏度冰箱保存；
（2）茎段预培养处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在超净工作台中切成3-4cm的带有多个芽点的茎段，接入MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.5mg/LKT+0.5g/LAC+30g/L蔗糖的培养基中，预培养2-3天，至茎段的侧芽部位出现肉眼可见白色芽点；
（3）诱导剂浸泡处理：将已长出芽的长茎段浸泡于0.002%氨磺灵溶液中，置于23摄氏度、12小时光照条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：石研，曾黎辉，曾敏婕，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35