本发明专利技术为一种用于人体维生素B12含量检测的释放剂及其应用，包括变性剂R1和中和剂R3；变性剂R1为Tris‑Hcl体系强碱溶液，中和剂R3为Tris‑Hcl体系的无水乙醇、三(2‑羧乙基)膦溶液。本发明专利技术提供的维生素B12释放剂通过变性剂R1强碱溶液从结合蛋白中解离维生素B12，然后在中和剂R3的作用下实现磁微粒化学发光检测，B12释放剂与对应的检测试剂及检测方法，可有效、完全的释放样本中的维生素B12，检测结果灵敏度高，能够检测到低浓度维生素B12，重复性好，性能能达到国际产品的水平。并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床应用。
【技术实现步骤摘要】
一种用于人体维生素B12含量检测的释放剂及其应用
本专利技术涉及医用体外免疫诊断试剂领域，具体是一种用于血清或肝素血浆中维生素B12含量检测的释放剂的制备，应用于一种采用磁微粒化学发光技术和抗原-抗体结合技术检测人体维生素B12含量的磁微粒化学发光检测试剂。
技术介绍
维生素B12，又名氰钴胺素，是一种一个钴原子周围的有四个吡咯环的类咕啉化合物，分子量为1355。钴胺素主要来源于动物产品，如肉、蛋、牛奶和其他乳制品。人体吸收维生素B12需要借助一种胃肠道分泌物(内因子)，维生素B12和这种蛋白质附着在回肠黏膜上的受体形成一种复合体，在回肠粘膜上一种被称为运钴胺素的蛋白质将维生素B12从黏膜细胞中转移到血液和组织中。除储存在骨髓以及其他组织外，大多数维生素B12被储存在肝脏。如果需要，它们就会由B12结合蛋白质(转钴胺)承载并释放到血浆中去。维生素B12在体内以辅酶的形式存在，可以增加叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；其和叶酸一样都是正常DNA(脱氧核糖核酸)合成中所不可或缺的，具有活化氨基酸的作用和促进核酸的生物合成，可促进蛋白质的合成，它对婴幼儿的生长发育有重要作用；促进红细胞的发育和成熟，使肌体造血机能处于正常状态，预防恶性贫血，维护神经系统健康；参与新陈代谢，是神经系统功能健全不可缺少的维生素，并参与神经组织中一种脂蛋白的形成。VitaminB12和叶酸是通过蛋氨酸合成的反应路径连接的，所以两者中任何一样缺乏都会扰乱代谢途径，导致同样的症状和医学问题。在临床上维生素B12常与叶酸、同型半胱氨酸、铁蛋白等联合检测，用于对糖尿病、贫血症等进行临床分析。大量的研究表明维生素B12贫乏也是巨幼红细胞性贫血症的诱因，同时也与老年痴呆症、抑郁症以及冠心病等有关。维生素B12缺乏也是怀孕早期流产、反复性流产的危险因素之一。人体缺乏维生素B12时易造成神经系统不可逆损害，引起烦躁不安、记忆衰退等症状。过量的摄入可能会出现哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能引发神经兴奋、心前区痛和心悸；也有报道认为过量可能会促进肿瘤发生。因此临床上建议对该类维生素做到先检测再补充，不缺乏不补充。目前，定量测定VB12的方法，有微生物学法，高效液相色谱法(HPLC)，酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)以及放射免疫法(RIA)。维生素B12在体内是与蛋白结合而存在的，所以在检测血清或血浆等生物样本时，需要对样本进行前处理，使其将维生素B12由结合蛋白上释放出来，再进行检测。现有问题是对样本进行前处理时解离不彻底，导致检测结果不准确，且不能够检测到低浓度维生素B12水平，重复性较差，无法形成统一标准。
技术实现思路
本专利技术旨在阐述一种高效、简单、快速的用于人血清或肝素血浆中维生素B12含量检测的释放剂，并应用于相应的免疫检测方法中，以解决现有产品释放不完全、重复性差的技术问题。基于上述目的，本专利技术提供一种用于人血清或肝素血浆中维生素B12含量检测的释放剂，包括变性剂R1和中和剂R3；变性剂R1为Tris-Hcl体系强碱溶液，中和剂R3为Tris-Hcl体系的无水乙醇、三(2-羧乙基)膦溶液。所述变性剂R1的pH值为12.0～13.0，包括：Tris-Hcl，浓度为7.5～8.2g/L；氢氧化钠，浓度为20.0-22.0g/L。所述变性剂R1的pH值为12.5，包括：Tris-Hcl，浓度为8.0g/L；氢氧化钠，浓度为21.0g/L；其余为去离子水。变性剂R1的制备：称取纯化水700g，依次加入8gTris-Hcl、21g氢氧化钠混合均匀，调整pH至12.5±0.05范围内，用纯化水定重至1L。所述中和剂R3的pH值为6.0～6.6，包括：Tris-Hcl，浓度为90.0～90.8g/L；无水乙醇，浓度为200.0-220.0g/L；8-氨基-1-磺酸萘铵盐(ANS)，浓度为0.8-1.2g/L；三(2-羧乙基)膦，浓度为1.0-1.6g/L；EDTA，浓度为0.8-1.2g/L。所述中和剂R3的pH值为6.3，包括：Tris-Hcl，浓度为90.4g/L；无水乙醇，浓度为210.0g/L；8-氨基-1-磺酸萘铵盐，浓度为1.0g/L；三(2-羧乙基)膦，浓度为1.3g/L；EDTA，浓度为1.0g/L；其余为去离子水。中和剂R3的制备：称取纯化水700g，依次加入90.4gTris-Hcl、210g无水乙醇、1g8-氨基-1-磺酸萘铵盐、1.3g三(2-羧乙基)膦、1gEDTA混合均匀，调整pH至6.3±0.05范围内，用纯化水定重至1L。一种测定人体维生素B12含量的磁微粒化学发光检测试剂，使用上述的释放剂，包括变性剂R1、中和剂R3，维生素B12试剂R2(简称试剂R2)、磁分离试剂、校准品、质控品、化学发光底物液。以下实施例中，所使用的维生素B12试剂R2、磁分离试剂、校准品、质控品、化学发光底物均来自于利德曼公司生产的试剂。一种测定人体维生素B12含量的磁微粒化学发光检测试剂的检测方法包括如下步骤：(1)将待测样本或校准品或质控品分别与变性剂R1一起加入反应管中，37℃混合温育5min；(2)依次将中和剂R3、试剂R2组分加入步骤(1)温育后的样品中，再于37℃继续温育15min；(3)将磁分离试剂加入步骤(2)温育后的样品中，于37℃继续温育5min；(4)洗涤，去除未结合的抗体和杂质；(5)加入化学发光底物液，ALP催化底物发光后测定相对发光强度RLU；在一定范围内相对发光强度RLU与维生素B12抗原浓度呈反比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的维生素B12含量。采用上述维生素B12检测试剂测定人体维生素B12含量时的方法学鉴定数据可达到如下指标：灵敏度：最低检出量为20.00pg/ml；重复性：质控品QC1精密度为5.24％(n＝10，为重复次数)，质控品QC2精密度为4.62％(n＝10，为重复次数)，精密度远低于行业要求，说明使用本专利技术稀释剂的检测试剂在实验过程中具有很好的可重复性；相关性：用实施例中的试剂同进口化学发光磁微粒免疫检测法试剂盒对77份样本进行同时检测，以本专利技术试剂测定维生素B12浓度为纵坐标，以进口化学发光法免疫检测试剂盒测定的结果为横坐标作回归分析，相关方程为y＝1.0473x+5.18，相关系数R2＝0.9799，经统计学处理结果表明，相关性良好。从上面所述可以看出，本专利技术的优点是：1.本专利技术中变性剂R1为Tris-Hcl体系的强碱溶液，可使结合蛋白变性后充分解离，中和剂R3为Tris-Hcl系统的无水乙醇、三(2-羧乙基)膦酸性溶液，还加入8-氨基-1-磺酸萘铵盐，既保障了特异性抗体在加入之前具有合适pH的缓冲体系，其中的无水乙醇为低毒有机溶剂，羟基的极性可溶解很多离子化合物；8-氨基-1-磺酸萘铵盐及三(2-羧乙基)膦与无水乙醇协同作用，起到进一步解离及稳定的作用，同时三(2-羧乙基)膦本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于人体维生素B12含量检测的释放剂及其应用，其特征在于，包括变性剂R1和中和剂R3；变性剂R1为Tris-Hcl体系强碱溶液，中和剂R3为Tris-Hcl体系的无水乙醇、三(2-羧乙基)膦溶液。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于人体维生素B12含量检测的释放剂及其应用，其特征在于，包括变性剂R1和中和剂R3；变性剂R1为Tris-Hcl体系强碱溶液，中和剂R3为Tris-Hcl体系的无水乙醇、三(2-羧乙基)膦溶液。
2.根据权利要求1所述的释放剂，其特征在于，所述变性剂R1的pH值为12.0～13.0，包括：Tris-Hcl，浓度为7.5～8.2g/L；氢氧化钠，浓度为20.0-22.0g/L。
3.根据权利要求2所述的释放剂，其特征在于，所述变性剂R1的pH值为12.5，包括：Tris-Hcl，浓度为8.0g/L；氢氧化钠，浓度为21.0g/L；其余为去离子水；变性剂R1的制备：称取纯化水700g，依次加入8gTris-Hcl、21g氢氧化钠混合均匀，调整pH至12.5±0.05范围内，用纯化水定重至1L。
4.根据权利要求1所述的释放剂，其特征在于，所述中和剂R3的pH值为6.0～6.6，包括：Tris-Hcl，浓度为90.0～90.8g/L；无水乙醇，浓度为200.0-220.0g/L；8-氨基-1-磺酸萘铵盐(ANS)，浓度为0.8-1.2g/L；三(2-羧乙基)膦，浓度为1.0-1.6g/L；EDTA，浓度为0.8-1.2g/L。
5.根据权利要求4所述的释放剂，其特征在于，所述中和剂R3的pH值为6.3，包括：Tris-Hcl，浓度为90.4g/L；无水乙醇，浓度为210.0g/L；8-氨基-1-磺酸萘铵盐，浓度为1.0g/L；三(2-羧乙基)膦，浓度为1.3g/L；E...
【专利技术属性】
技术研发人员：仝艳艳，王鹏，
申请(专利权)人：北京利德曼生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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