半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚A ABC酶联免疫吸附检测方法技术

本发明专利技术公开了一种半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚A亲和素‑生物素化酶复合物酶联免疫吸附检测方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)包被：用包被缓冲液将半抗原BVA包被过夜；(2)封闭：包被后的BVA加入OVA进行封闭；(3)竞争：标准曲线孔将BPA标准溶液用DMSO稀释；待检测孔加入待检测样品；然后向每孔再加入BPA单克隆抗体；(4)加生物素标记的二抗：用抗体稀释液将生物素标记羊抗小鼠IgG1:10000稀释，孵育；(5)加ABC复合物：用10％胎牛血清溶液将ABC复合物稀释，100μL/孔；孵育；(6)显色；(7)终止；(8)结果测定：用酶标仪测定492nm处的吸光值。

【技术实现步骤摘要】
半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚AABC酶联免疫吸附检测方法
本专利技术涉及一种半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚A(BPA)亲和素-生物素化酶复合物(ABC)酶联免疫吸附检测法。
技术介绍
双酚A作为生产聚碳酸酯和环氧树脂的重要原料，环境暴露量在逐年升高，可通过干扰内分泌功能对生物体产生多种毒性作用。目前国内外对于BPA的检测主要采用仪器分析法，这些检测方法依赖价格昂贵的检测设备，例如高效液相色谱、气相色谱、质谱等，操作和样品前处复杂，且不能同时对大量样品进行检测。ELISA依赖高特异性的抗体，利用抗原-抗体特异性反应很好的弥补了仪器分析法的不足。目前虽已有BPAELISA检测方法的报道，但是检测抗体多使用多克隆抗体，包被抗原为人工抗原。多克隆抗体均一性差、灵敏度低且不能大量获得；人工抗原包被是通过疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合，会造成抗原构象改变，影响疏水半抗原的呈现与识别，另外不同批次的人工抗原即使合成条件相同也不能保证每次合成得到的人工抗原完全相同。这些都会影响检测的灵敏度，使得检测方法的标准化难度增大。但是由于多克隆抗体制备难度小，人工抗原直接包被方法简便，使得为数不多的BPAELISA检测方法还是采用多克隆抗体为检测抗体，以人工抗原作为包被抗原。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚A(BPA)亲和素-生物素化酶复合物(ABC)酶联免疫吸附检测法，克服以下技术问题：1、制备高特异性、高灵敏度的BPA单克隆抗体；2、将BPA半抗原BVA直接包被于酶标板上；3、配合ABC复合物使用，优化ELISA检测条件构建最优的ELISA检测条件组合。本专利技术的技术方案是：一种半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚A亲和素-生物素化酶复合物酶联免疫吸附检测方法，包含以下步骤：(1)包被：用包被缓冲液将半抗原BVA包被过夜；(2)封闭：包被后的BVA加入OVA进行封闭，孵育，加入洗涤缓冲液，重复洗2次以上；(3)竞争：标准曲线孔将BPA标准溶液用DMSO稀释；待检测孔加入待检测样品；然后向每孔再加入BPA单克隆抗体，充分混匀；另设一个阳性对照孔加入竞争反应稀释液和2倍工作浓度的单抗，孵育；洗2次以上；(4)加生物素标记的二抗：用抗体稀释液将生物素标记羊抗小鼠IgG1:10000稀释，100-150μL/孔；孵育，洗2次以上；(5)加ABC复合物：用10％胎牛血清溶液将ABC复合物稀释，100-150μL/孔；孵育，洗2次以上；(6)显色：每孔加新鲜配置的底物显色液，室温避光反应；(7)终止：加终止液；(8)结果测定：用酶标仪测定492nm处的吸光值。所述的BVA为包被半抗原，BPA单克隆抗体实际工作浓度则为50ng/mL，ABC复合物实际工作浓度为50ng/mL，竞争反应体系添加10％的DMSO，pH＝7.4，25℃。最低检测限IC10为0.24ng/mL，半数抑制率IC50为2.74ng/mL。所述的BPA单克隆抗体的制备方法：采用小鼠腹水法复壮Sp2/0细胞后，利用淋巴细胞杂交瘤技术制备并筛选出能稳定分泌BPA抗体的杂交瘤细胞株。所述的包被半抗原的制备方法：将HNO3/H2SO4加入酶标板，室温硝化，加入APTES室温反应，移至62℃继续反应，加入经NHS和DCC活化的BVA，4℃过夜，最后加入0.2mol/L的甲醛37℃反应2h封闭酶标板表面多余的氨基。所述的ABC复合物的制备方法：将亲和素与辣根过氧化物酶标记的生物素按分子比1:3的比例溶于10％胎牛血清溶液中，溶液在4℃下反应过夜形成ABC复合物待用。本专利技术的有益效果：本方法首先合成了BPA人工抗原，构建了一株可以稳定分泌BPA单克隆抗体的细胞株，在制备单克隆抗体的相关步骤进行了改进，将获得的单克隆抗体作为BPA的检测抗体；在进行ELISA方法构建时，将BPA的半抗原双酚酸(BVA)直接包被在酶标板上，配合亲和素-生物素酶复合物(ABC)的使用，在此基础上对ELISA检测方法反应体系的包被抗原浓度和抗体工作浓度、有机溶剂种类和含量、反应温度、pH值、封闭剂种类等条件进行优化，确立了一种半抗原直接包被的基于单克隆抗体的BPAABC-ELISA检测法。与多克隆抗体ELISA相比：多克隆抗体检测灵敏度远不如单克隆抗体这是学术界的共识，例如石春红，酶联免疫法检测双酚A的研究，江南大学(硕士毕业论文)中，采用BPA多克隆抗体构建ELISA检测方法，半数抑制率IC50为10μg/mL，远远高于半抗原包被的ABC-ELISA，说明检测灵敏度核特异性均不如半抗原包被的ABC-ELISA。例如匡华等，抗双酚A多克隆抗体的制备，安徽农业科学，2011，39(34):21353－21354，采用BPA多克隆抗体构建ELISA检测方法，半数抑制率IC50为17.2ng/mL，也远远高于半抗原包被的ABC-ELISA，说明检测灵敏度核特异性均不如半抗原包被的ABC-ELISA。与人工抗原包被ELISA相比：我们同时也做了人工抗原包被的ELISA作为对比，结果是最低检测限IC10为0.5ng/mL，半数抑制率IC50为16.63ng/mL。显著高于半抗原包被的ABC-ELISA，说明检测灵敏度核特异性均不如半抗原包被的ABC-ELISA。附图说明图1为半抗原包被的ABC-ELISA法标准曲线。具体实施方式一、BPA半抗原的选择和完全抗原的构建选用BVA，含有活性基团(－COOH)，作为BPA的半抗原。采用碳化二亚胺法将半抗原与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)连接。合成完全抗原BVA-BSA、BVA-OVA。碳化二亚胺法合成完全抗原具体操作步骤：取0.9mgBVA、2.98mgNHS、4.56mgEDAC溶于300μLDMF中，17℃，130r/min，避光反应16h，得到溶液A。将12mgBSA和12mgOVA分别溶于2mL，pH＝9的PBS中，得到溶液B。将溶液A逐滴加入溶液B中，搅拌均匀后室温下避光反应12h，得到溶液C。将溶液C在6000rmp离心5min，取上清液装入透析袋置于pH＝7.4，0.01mol/L的PBS中，4℃透析至少48h，每隔12h换液1次。对所得的人工抗原进行紫外扫描确定偶联是否成功，采用Folin-酚法进行完全抗原浓度的测定，-20℃保存备用。二、免疫BALB/c小鼠制备高校价、高灵敏度抗血清对BALB/c小鼠进行人工抗原BVA-BSA、BVA-OVA免疫，制备抗血清，免疫方案如下。第4次免疫结束后7天从小鼠尾部取血，得到抗血清，对抗血清的效价和灵敏度采用间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定，根据检测结果选择BVA-OVA为免疫原，BVA-BSA为包被原。抗血清的效价>128000，IC50＝221ng/mL。免疫方案...

【技术保护点】
1.一种半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚A ABC酶联免疫吸附检测方法，其特征在于：包含以下步骤：/n(1)包被：用包被缓冲液将半抗原BVA包被过夜；/n(2)封闭：包被后的BVA加入OVA进行封闭，孵育，加入洗涤缓冲液，重复洗2次以上；/n(3)竞争：标准曲线孔将BPA标准溶液用DMSO稀释；待检测孔加入待检测样品；然后向每孔再加入BPA单克隆抗体，充分混匀；另设一个阳性对照孔加入竞争反应稀释液和2倍工作浓度的单抗，孵育；洗2次以上；/n(4)加生物素标记的二抗：用抗体稀释液将生物素标记羊抗小鼠IgG 1:10000稀释，100-150μL/孔；孵育，洗2次以上；/n(5)加ABC复合物：用10％胎牛血清溶液将ABC复合物稀释，100-150μL/孔；孵育，洗2次以上；/n(6)显色：每孔加新鲜配置的底物显色液，室温避光反应；/n(7)终止：加终止液；/n(8)结果测定：用酶标仪测定492nm处的吸光值。/n

【技术特征摘要】
1.一种半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚AABC酶联免疫吸附检测方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1)包被：用包被缓冲液将半抗原BVA包被过夜；
(2)封闭：包被后的BVA加入OVA进行封闭，孵育，加入洗涤缓冲液，重复洗2次以上；
(3)竞争：标准曲线孔将BPA标准溶液用DMSO稀释；待检测孔加入待检测样品；然后向每孔再加入BPA单克隆抗体，充分混匀；另设一个阳性对照孔加入竞争反应稀释液和2倍工作浓度的单抗，孵育；洗2次以上；
(4)加生物素标记的二抗：用抗体稀释液将生物素标记羊抗小鼠IgG1:10000稀释，100-150μL/孔；孵育，洗2次以上；
(5)加ABC复合物：用10％胎牛血清溶液将ABC复合物稀释，100-150μL/孔；孵育，洗2次以上；
(6)显色：每孔加新鲜配置的底物显色液，室温避光反应；
(7)终止：加终止液；
(8)结果测定：用酶标仪测定492nm处的吸光值。


2.根据权利要求1所述的半抗原直接包被的基于单克隆抗体的双酚AABC酶联免疫吸附检测方法，其特征在于：所述的BVA为包被半抗原，BPA单克隆抗体实际工作浓度则为50ng/mL，ABC复合物实际工作浓度为50ng/mL，竞争反应体系添加10％的DMSO，p...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭东，张玉超，袁德志，刘良禹，杨旭，
申请(专利权)人：茅台学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52