一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，属于林木细胞工程技术领域。该方法通过采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，分离出未成熟合子胚，诱导培养出含胚性胚柄细胞团的胚性愈伤组织，并将获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，经继代培养，获得大量增殖的胚性愈伤组织。本发明专利技术不受季节和外部环境的限制，能高效诱导出胚性愈伤组织，并在维持和增殖培养基中短期内获得大量白色且质地紧实的胚性愈伤组织，为中山杉优良品系的快速繁殖提供了一种高效途径，不仅有利于优良种质资源的保存，为后续再生植株和遗转化受体体系提供前期基础，而且可以实现大量繁殖优质种苗的目标，极大满足市场需求。

【技术实现步骤摘要】
一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法
本专利技术属于林木细胞工程
，具体涉及一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法。
技术介绍
落羽杉属(TaxodiumRich.)属于杉科(Taxodiaceae)，属内主要分3个种，落羽杉(Taxodiumdistichum(Linn.)Rich.)、池杉(T.ascendensBrongn)和墨西哥落羽杉(T.mucronatumTenore)。落羽杉属均为高大乔木，由于扎根深、根系庞大，扩基快，在欧美等国广泛用于湿地造林、防风固土和填充沟壑。中山杉(Taxodium‘Zhongshanshan’)也称杂交落羽杉，主要是落羽杉，墨西哥落羽杉，池杉3个树种种间杂交得到的优良无性系的总称。中山杉兼具了落羽杉属树种间的主要优点：半常绿高大乔木，树干挺拔、树形优美、枝叶茂盛、树冠紧凑圆满、落叶期极短，生长快，抗风，耐盐碱，耐水淹，成材率好，观赏价值高等。目前在江苏、浙江、重庆、云南等十多个沿海、内陆省(市)累计造林示范面积超过1.9×104ha，在我国未来用材林、能源林、碳汇林、休闲林和水源涵养林等营造以及沿海防护林建设、公路及城乡绿化、农田林网和滩涂造林等方面均有着巨大的应用潜力。中山杉虽能自然结实，但出苗率极低，育种周期长，良种繁育目前主要采用传统的扦插繁育技术，但是受自然环境和季节性限制较大，长期持续生产非常困难。目前虽有中山杉关于不定芽增殖的报道，但增殖率低，生根困难，不足以短期满足苗木市场的巨大需求。林木体细胞胚发生技术是目前林木繁殖效率最高，最具有应用前景的技术。林木体胚发生技术是在人工条件下通过诱导体细胞转向胚性细胞发育，获得胚性细胞，然后经过人工控制条件诱导形成体细胞胚，然后体细胞胚萌发进一步形成完整再生植株，原则上一个胚性细胞(团)发育成一株苗，具有无限性。在林木体胚发生技术中，胚性愈伤组织的诱导和胚性细胞维持和增殖是体胚发生体系的关键起始步骤。因此，首先建立一种高效、稳定的胚性愈伤组织的诱导、维持和增殖方法的十分必要。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，包括以下步骤：1)采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，经表面灭菌后，无菌条件下，分离出未成熟合子胚；2)在无菌条件下，将未成熟合子胚接种至诱导固体培养基中诱导培养获得含胚性胚柄细胞团的胚性愈伤组织；3)在无菌条件下，将步骤2)获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，经继代培养，获得大量增殖的胚性愈伤组织。进一步的，步骤1)中，8月中下旬至9月中旬采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，经75％乙醇和2.5％次氯酸钠进行表面灭菌后(75％乙醇先浸泡45～60秒，然后用2.5％次氯酸钠溶液灭菌18～20分钟，最后用无菌水冲洗3～4遍)，无菌条件下，分离出未成熟合子胚。进一步的，步骤1)中，8月中下旬采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子。进一步的，步骤2)中，诱导固体培养基的配方为改良DCR基本培养基添加有NAA、6-BA、L-Glu、Pro、Inositol、Maltose和琼脂；步骤3)中，维持和增殖固体培养基的配方为3/4改良DCR基本培养基添加有NAA、6-BA、KT、Pro、Inositol、CH、Maltose和琼脂。进一步的，改良DCR基本培养基是以DCR基本培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整以下组分的含量为：NH4NO3400mg/L，KNO3340mg/L，MgSO4·7H2O180mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2·2H2O85mg/L，Ca(NO3)2·4H2O556mg/L。进一步的，步骤2)中，诱导固体培养基的配方为：改良DCR基本培养基+NAA2.0～4.0mg/L+6-BA0.5～1.5mg/L+L-Glu0.3g/L+Pro0.2g/L+Inositol0.2g/L+Maltose25g/L+琼脂8.5g/L。进一步的，步骤3)中，维持和增殖固体培养基的配方为：3/4改良DCR基本培养基+NAA1.0～2.0mg/L+6-BA0.2～0.5mg/L+KT1.0mg/L+Pro0.2g/L+Inositol0.2g/L+CH0.5g/L+Maltose30g/L+琼脂8.5g/L。进一步的，步骤2)中，诱导培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，培养20～25天。进一步的，步骤3)中，继代培养的条件为：黑暗条件，控温23℃，每隔18～20天继代一次。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：本专利技术针对当前中山杉不定芽增殖生根困难、植株再生率低、扦插繁育难以长期持续生产，较难满足生产应用需要等问题，提供了一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织，不受季节和外部环境的限制，能高效诱导出胚性愈伤组织，并在维持和增殖培养基中短期内获得大量白色且质地紧实的胚性愈伤组织，为中山杉优良品系的快速繁殖提供了一种高效途径，不仅有利于优良种质资源的保存，为后续再生植株和遗转化受体体系提供前期基础，而且可以实现大量繁殖优质种苗的目标，极大满足市场需求。附图说明图1为中山杉未成熟合子胚图；图2为未成熟胚诱导出的初始胚性愈伤组织图；图3为增殖和维持培养中的胚性愈伤组织图；图4为胚性愈伤组织显微照片，箭头为胚性胚柄细胞团。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。以下实施例中如无特殊说明，所用实验方法均为常规方法。以下实施例中所用到的改良DCR基本培养基配方为：NH4NO3400mg/L，KNO3340mg/L，MgSO4·7H2O180mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2·2H2O85mg/L，Ca(NO3)2·4H2O556mg/L，KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·4H2O6.9mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，CuSO4·5H2O0.25mg/L，NiCl20.025mg/L，FeSO4·7H2O27.80mg/L，Na2-EDTA·2H2O37.30mg/L，肌醇200.00mg/L，烟酸0.50mg/L，甘氨酸2.00mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L。实施例1(1)中山杉未成熟合子胚的准备8月下旬至9月中旬每隔7天采集中山杉未成熟球果，迅速置于4℃冷藏保存。取出合子胚于解剖镜下观察，取发育至早期子叶胚的种子，用75％乙醇先浸泡45～60秒，然后用2.5％次氯酸钠溶液灭菌18～20分钟，最后用无菌水冲洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，经表面灭菌后，无菌条件下，分离出未成熟合子胚；/n2)在无菌条件下，将未成熟合子胚接种至诱导固体培养基中诱导培养获得含胚性胚柄细胞团的胚性愈伤组织；/n3)在无菌条件下，将步骤2)获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，经继代培养，获得大量增殖的胚性愈伤组织。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，经表面灭菌后，无菌条件下，分离出未成熟合子胚；
2)在无菌条件下，将未成熟合子胚接种至诱导固体培养基中诱导培养获得含胚性胚柄细胞团的胚性愈伤组织；
3)在无菌条件下，将步骤2)获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，经继代培养，获得大量增殖的胚性愈伤组织。


2.根据权利要求1所述的利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，其特征在于，步骤1)中，8月中下旬至9月中旬采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，经75％乙醇和2.5％次氯酸钠进行表面灭菌后，无菌条件下，分离出未成熟合子胚。


3.根据权利要求1所述的利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，其特征在于，步骤1)中，8月中下旬采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子。


4.根据权利要求1所述的利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，其特征在于，步骤2)中，所述诱导固体培养基的配方为改良DCR基本培养基添加有NAA、6-BA、L-Glu、Pro、Inositol、Maltose和琼脂；步骤3)中，所述维持和增殖固体培养基的配方为3/4改良DCR基本培养基添加有NAA、6-BA、KT、Pro、Inositol、CH、Maltose和琼脂。


5.根据权利要求4所述的利用中山杉未成熟胚诱导胚性愈伤组织与增殖的方法，其特征在于，所述改良DCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：周艳威，张凡，陈红，王传永，李云龙，陆小清，李乃伟，蔡小龙，种昕冉，周婷，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32