本发明专利技术提供了一种简单，快速、信号增强的双DNA镊子纳米机器，用于一步同时检测食品样品中的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A。当双DNA镊子被霉菌毒素的适体锁定时，荧光信号“关闭”。在存在黄曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A的情况下，适体可以与其相应的靶标结合，从而导致DNA镊子的“打开”和荧光信号的“开启”。黄曲霉毒素B1的检出限为3.5
【技术实现步骤摘要】
一种检测食品样品中的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的方法
[0001]本专利技术涉及食品样品中的霉菌毒素的检测领域，特别是基于双DNA镊子纳米机器的霉菌毒素的检测方法领域。
技术介绍
[0002]霉菌毒素是真菌产生的具有不同结构和毒性作用的次生代谢产物，主要属于曲霉属，青霉属和镰刀菌属。霉菌毒素的分子量低，分子结构的多样性高，即使在低浓度下也能在人类和动物中引起一系列生物学效应。在约600种真菌代谢物中，只有极少数霉菌毒素包括黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)对人类和动物构成严重威胁。AFB1由真菌黄曲霉和曲霉生长期间产生。国际癌症研究机构(IARC)已将其归类为第一类致癌物。欧盟和各种政府机构为食品安全和公共卫生制定了人类食品和动物饲料中AFB1的最大残留量(MRL)。AFB1和黄曲霉毒素的总限量分别设置为5μg/kg和10μg/kg。OTA被认为是最潜在的肾致癌物之一，它是最常见的自然产生的真菌毒素，主要由曲霉和绿霉菌产生。OTA对实验室和农场动物具有肾毒性，肝毒性，免疫毒性和胚胎毒性。IARC将其归类为2B类可能是人类致癌物。自2012年1月7日以来，某些香料中OTA的最大残留限量已从30μg kg-1降至15μg kg-1。
[0003]已经开发出许多测定AFB1和OTA的方法。基于色谱和免疫分析的方法是官方实验室中常规真菌毒素分析的最常见商业方法。这些方法显示出对霉菌毒素检测的高灵敏度和选择性。但是，色谱法受限于昂贵的仪器，经验丰富的操作员和繁琐的预处理。另外，免疫测定法在运输和储存中遭受抗体的稳定性的困扰。因此，迫切需要开发一种简单而灵敏的方法来现场和实时检测AFB1和OTA。
[0004]适体是从“通过指数富集的配体的系统进化(SELEX)”获得的单条核酸，能够紧密结合并选择性地靶向天然抗体。它已被用作传感器设计中理想的组件，用于检测蛋白质，肽，小分子和细胞。DNA镊子是一种由DNA编程和构建的纳米结构。它可以实现纳米尺度的纳米机械运动。DNA镊子由于其简单的结构和直接的响应机制而在传感器设计中具有独特的优势。它显示了可感知核酸，金属离子，蛋白质，酶和pH值的纳米级可控性和生物相容性。但是，尚未有DNA镊子用于霉菌毒素检测。
技术实现思路
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供一种基于双DNA镊子纳米机器同时检测AFB1和OTA的检测方法。
[0006]本专利技术包括如下步骤：
[0007](1)双DNA镊子纳米机的制备
[0008]在10mM Tris-HCl缓冲液中以1：1的摩尔比制备序列为1-6的双DNA镊子纳米机，其中，DNA序列1-6 5
’-3’
为：
[0009]1：FAM-TATATA-GTCCTATCTATGATGGCCCCTTTGTAGACTCAGGAT-AATATT-BHQ3。
[0010]2：Cy5-TGCCCA-ATGACACATCACTAGGCCCCGTTGGAGCGACATTAG-TCCGAT-DABCYL
[0011]3：CTAATGTCGCTCCAACAACCATCATAGATAGGAC
[0012]4：ATCCTGAGTCTACAAATACCTAGTGATGTGTCAT
[0013]5：GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-TATATA
[0014]6：AATATT-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCAC
[0015](2)一步同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A：
[0016]将待检测样品添加到步骤(1)制备的双DNA镊子纳米机器溶液中，检测混合溶液的荧光光谱，用标准曲线法计算样品中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的浓度。
[0017]优选的，步骤(1)中，Tris-HCl缓冲液pH 7.5，含有0.3mM KCl。
[0018]优选的，步骤(1)中，制备的双DNA镊子纳米机器，最终浓度为0.5μM。
[0019]优选的，步骤(1)中，双DNA镊子纳米机器溶液，在90℃下孵育5分钟，然后缓慢冷却至25℃，以形成特定的双DNA镊子纳米机器。
[0020]优选的，步骤(2)中，将待检测样品添加到步骤(1)制备的双DNA镊子纳米机溶液中之后，在室温下孵育30分钟。
[0021]优选的，步骤(2)中，对于486nm激发的羧基荧光素(FAM)荧光，在505nm至600nm检测混合溶液的荧光光谱，对于640nm激发的吲哚-5-菁(Cy5)荧光，在650nm至750nm检测混合溶液的荧光光谱。
[0022]本专利技术开发了一种带有双DNA镊子的简单快速的DNA纳米机器，用于一步同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A。在DNA纳米机器的两端形成的两个DNA镊子共享两个长臂序列。荧光团和淬灭剂分别在每个DNA镊子的两个臂的末端进行了修饰。DNA镊子的两条臂被霉菌毒素的适体链紧密锁住，导致荧光信号低。在存在黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的情况下，适体链可以与其相应的靶标结合，从而导致DNA镊子的“打开”和荧光信号的“开启”。该策略简单，快速且具有成本效益，为同时检测两种霉菌毒素提供了一个强大的平台。
附图说明
[0023]图1为本专利技术的原理图。
[0024]图2为黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A在3小时内的荧光信号。
[0025]图3为不同样品的荧光强度图。
[0026]图4图4.(A)双DNA镊子纳米机对不同浓度的中文翻译是什么的荧光光谱(左，曲线a-h：8.0
×
10-2、0.5、1、5、10、15、30和50ng/mL)和赭曲霉毒素A(右，曲线a-h：0.5、2、10、20、50、100、150和200ng/mL)。(B)黄曲霉毒素B1浓度与荧光反应之间的关系。插图：黄曲霉毒素B1浓度对荧光强度的标准曲线，范围为8.0
×
10-2至10ng/mL。(C)赭曲霉毒素A浓度与荧光反应之间的关系。插图：赭曲霉毒素A浓度对荧光强度的校准图，范围为0.5至50ng/mL。(D)双DNA镊子纳米机器对黄曲霉毒素1和赭曲霉毒素A的某些类似物的特异性。黄曲霉毒素1和赭曲霉毒素A的浓度分别设置为10和50ng/mL。空白为缓冲溶液。混合1是AFB1(黄曲霉毒素B1)，OTA(赭曲霉毒素A)，AFB2(黄曲霉毒素B2)，AFM1(黄曲霉毒素M1)，OTB(赭曲霉毒素B)和ZEA(玉米赤霉烯酮)；混合2是AFB2(黄曲霉毒素B2)，AFM1(黄曲霉毒素M1)，OTB(赭曲霉毒素B)和ZEA(玉米赤霉烯酮)。
具体实施方式
[0027]下面结合实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0028]如图1所示，本专利技术的原理为：双DNA镊子纳米机器由6条DNA链形成。序列3的两个末端区域与序列1和2具有16个碱基对互补，形成一个DNA镊子的臂。序列4还可在另一侧以相同方式与序列1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测食品样品中的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的方法，包括以下步骤：(1)双DNA镊子纳米机器的制备在10mM Tris-HCl缓冲液中以1：1的摩尔比混合DNA序列1-6以制备双DNA镊子纳米机器，其中，DNA序列1-6的5
’-3’
的序列为：1：FAM-TATATA-GTCCTATCTATGATGGCCCCTTTGTAGACTCAGGAT-AATATT-BHQ3。2：Cy5-TGCCCA-ATGACACATCACTAGGCCCCGTTGGAGCGACATTAG-TCCGAT-DABCYL3：CTAATGTCGCTCCAACAACCATCATAGATAGGAC4：ATCCTGAGTCTACAAATACCTAGTGATGTGTCAT5：GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-TATATA6：AATATT-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCAC(2)一步同时检测黄曲霉毒素B1...
【专利技术属性】
技术研发人员：云雯，陈红，吴虹，熊政委，
申请(专利权)人：重庆工商大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。