本发明专利技术涉及抗人CS1抗原的单克隆抗体及其单链可变片段(scFv)，包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区V
【技术实现步骤摘要】
一种抗人CS1抗原的单克隆抗体及其CAR-T细胞
[0001]本专利技术涉及一种能特异性抑制人多发性骨髓瘤及其他CS1阳性肿瘤细胞生长的新型抗CS1抗原的单克隆抗体(克隆5G5A4)，以及表达含有该单克隆抗体序列的嵌合抗原受体的T免疫细胞(CAR-T)或自然杀伤细胞(CAR-NK)等，它们在肿瘤过继免疫治疗中起作用。
技术介绍
[0002]细胞与免疫治疗是一种非常有前景的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们人体免疫系统细胞免疫的重要组成部分，它通过不断寻找和识别外来、异己抗原，从体细胞中区分正常细胞和异常细胞(癌细胞或受病毒感染细胞)并杀灭与清除异常细胞。利用表达嵌合抗原受体的载体对T细胞进行基因修饰是设计特异性肿瘤T细胞的常用方法。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞注入患者体内(称为过继细胞转移或ACT)是一种有效的免疫治疗方法
[1,2]。与化疗或者抗体疗法相比，CAR-T技术的优势在于基因重组的工程T细胞可以在病人体内增殖、持续存或并杀伤靶细胞(“活体药物”)
[1
,3
,4]。
[0003]CAR通常由源于单克隆抗体N端之单链可变片段(scFv)、铰链区、跨膜区和一些胞内共刺激结构域如(i)CD28、(ii)CD137(4-1BB)、CD27或其他共刺激结构域，及与其串联的CD3 zeta活化结构域组成
[2
,3](图1)。在图1中，左图为第一代的CAR结构(无共刺激结构域)；中图为第二代的CAR结构(一个共刺激结构域，CD28或4-BB)；并且右图为第三代的CAR结构(两个或多个共刺激结构域)。该图来自Golubovskaya,Wu,Cancers,2016年3月15日；8(3)。CAR的发展经历了从第一代(无共刺激结构域)到第二代(有一个共刺激结构域)，再到第三代(具有多个共刺激结构域)。包含有多个共刺激结构域的CAR(即第三代CAR)及其转染表达的CAR-T、CAR-NK细胞的应用使CAR-T、CAR-NK肿瘤杀伤活性增强，在体内的持久性延长，并且抗肿瘤疗效提高。
[0004]CS1抗原
[0005]CS1为淋巴细胞信号活化分子(SLAM家族第七成员，CD319抗原)，在多发性骨髓瘤细胞中过度表达。细胞外结构域如图2中下划线部分所示。基于其在多发性骨髓瘤中的高表达，它被用作制备治疗多发性骨髓瘤及CS1阳性肿瘤抗体或CAR-T细胞的靶点。
附图说明
[0006]图1：CAR的结构。
[0007]图2：CS1蛋白的氨基酸序列。
[0008]图3：CS1-CAR构建体的结构。
[0009]图4：在多发性骨髓瘤细胞系H929、MM1S、RPMI8226中检测到CS1，而在淋巴瘤、K562细胞中未检测到。
[0010]图5：检测稳定表达CS1抗原的CHO细胞中的CS1抗原。
[0011]图6：通过CS1抗体免疫组化染色检测CS1在不同组织中的表达。
[0012]图7：通过小鼠FAB抗体流式细胞术，可检测CAR表达阳性的T细胞。
[0013]图8：CS1-CAR-T细胞杀死CHO-CS1细胞，但不杀伤CHO细胞。
[0014]图9：CS1-CAR-T细胞在与RPMI8226、HT929和MM1S多发性骨髓瘤细胞共孵育后可特异性分泌IFN-γ。
[0015]图10：CS1-CAR-T细胞与CHO-CS1细胞共孵育后分泌高水平的IFN-γ，但与CHO细胞共孵育后未检测到IFN-γ分泌。
[0016]图11：RPMI8226肿瘤异种移植NSG小鼠分别经CS1-CAR-T细胞、PBS和T细胞处理后的体内肿瘤生长的影像学图像。
具体实施方式
[0017]定义
[0018]如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指融合蛋白，其由能与抗原结合的胞外结构域、源于多肽的跨膜结构域(该多肽不同于衍生胞外结构域多肽)、以及至少一个细胞内结构域组成。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体(CIR)”，“能够与抗原结合的胞外结构域”是指能与某一抗原结合的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知功能为传递信号以引起细胞内生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。
[0019]如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其他区域折叠成特定结构的一个区域。
[0020]如本文所用，“单链可变片段(scFv)”是指由保留结合抗原能力的抗体衍生的单链多肽。scFv的示例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)的可变区Fv片段通过间隔序列连接。用于工程化scFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
[0021]如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达引起癌症。
[0022]本专利技术人已构建了特异性靶向人CS1抗原的鼠抗人单克隆抗体。本专利技术人也已构建了CS1-CAR-T细胞，以靶向过度表达CS1抗原的癌细胞。本专利技术的CS1-CAR-T细胞对多种肿瘤细胞系具有高细胞毒活性。
[0023]本专利技术涉及一种抗人CS1抗原的单克隆抗体，包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VH片段和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL片段，本专利技术的抗CS1单克隆抗体具有抗人CS1抗原的特异性。在一个实施方式中，该抗人CS1单克隆抗体是单链可变区片段(scFv)。
[0024]本专利技术还涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)抗CS1单链可变片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，以及(iv)激活结构域。
[0025]本专利技术人已构建CS1-ScFv-CD28-CD3-CAR-T(CS1-CAR-T)细胞用以治疗CS1过表达的血液学癌症(包括多发性骨髓瘤)。本专利技术人提供了证明CS1在不同类型血液系统癌症(淋巴瘤、多发性骨髓瘤)中有效表达的数据。同时显示本专利技术的CS1-CAR-T细胞对CS1阳性癌细胞的杀伤活性高于未转染的T细胞和模拟CAR-T细胞。
[0026]本专利技术的CS1单克隆抗体或CS1-ScFv相对于其他已知的CS1抗体的优势在于，本专利技术抗体对淋巴瘤抗原和多发性骨髓瘤抗原都具有高的结合活性，并且其对CS1阳性癌细胞(包括淋巴瘤和多发性骨髓瘤)都具有高度的特异性。该CS1单克隆抗体或CS1-ScFv片段在血液系统肿瘤抗体治疗领域具有广泛的应用前景。作为治疗性抗体，此CS1抗体将在许多临床应用中显示很强的治疗作用。
[0027]本专利技术的小鼠抗人CS1单克隆抗体可检测CS1阳性癌细胞中的CS1抗原。
[0028]本专利技术的CS1抗体可用于免疫治疗：包括毒素/药物偶联抗体、治疗性单克隆抗体、CS1人源化抗体、CAR-T、CAR-NK细胞免疫治疗等。
[0029]使用本专利技术的CS1抗体构建的CS1-CAR-T、CS1-CAT-NK细胞可有效用于CS1阳性肿瘤治疗中的靶标CS1抗原：淋巴瘤、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗人CS1抗体，其包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的V
H
和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的V
L
。2.一种单链可变片段(scFv)，其包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的V
H
和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的V
L
。3.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，V，
申请(专利权)人：杭州中柏济元基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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