一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法技术

本发明专利技术涉及一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法，具体包括以下步骤：PD模型的构建、旋转行为学的监测、UC

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及帕金森病治疗技术，尤其是一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法。

技术介绍

[0002]大脑是人和高等动物意识与感觉的物质基础，人和动物的意识都与完善的大脑功能密切相关，其行为是受大脑活动支配的，大脑某一部分的损伤必然导致相应功能的衰减，神经递质的非正常代谢会引发多种神经疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等。帕金森病(Parkinson
′
s disease，PD)又名震颤麻痹，是中老年人多发的锥体外系疾病，是最常见的神经退行性疾病之一。
[0003]流行病学显示，在中国65岁以上人群中，有1％以上的人患有PD病，男性比女性更易患病，其主要症状为静止性震颤、运动缓慢、自主神经功能障碍、肌强直、姿势步态异常、认知/精神异常、感觉障碍等，其主要病理改变为黑质的多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的变性坏死，导致纹状体DA含量显著下降，而酪氨酸轻化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)是脑内DA能神经元的标志蛋白，起到调节DA生物合成的作用，其含量变化与PD病的发生密切相关。
[0004]PD病的发病因素多样，可能与年龄、遗传因素、社会因素、药物因素、氧化应激、细胞调亡、泛素蛋白酶系统损伤、异常蛋白沉积等因素有关。PD病目前是无法治愈的疾病，多巴胺受体、单胺氧化酶类等药物只能减轻PD病症状，随病程进展，其作用逐渐减弱甚至会出现一些并发症，因此深入研究其发病机制、临床行为学改变、病理生化改变，研究高效的建模方法，建立疾病动物模型，寻找适合的治疗药物势在必行。
[0005]目前科学研究PD模型中主要使用化学试剂进行PD动物模型的构建，其中主要试剂为6羟多巴胺(6-OHDA)，6-OHDA对于大鼠及灵长类动物是一种高效的毒物，广泛用来制作单侧损伤模型，最常用的建模方法是单侧注射6-OHDA至黑质或者中央前脑束，或者直接注射6-OHDA至纹状体内，前者使药物累积于DA神经元并对其产生毒性作用，可以使DA神经元细胞在较短时间内快速死亡，与急性MPTP模型类似，而后者则在四周时间内使神经元缓慢的部分损伤，多用来模拟PD的慢性病程，进而使DA神经元发生退行性病变，这两种模型的主要优点是可以通过旋转行为学直观量化的来进行监测，因而在药理学、药效学研究中常用于观察药物对多巴胺能神经的作用。
[0006]干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为多种组织细胞，其中来源于健康脐带组织的脐带间充质干细胞(UC-MSC)是干细胞家族中的重要成员之一，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，可进行免疫调节，其因取材方便、无道德伦理争议、可获取细胞数量多、繁殖力强、多次传代扩增后仍具有干细胞特性、使用安全可靠、制备简单等优点，使其广泛适用，目前UC-MSCs制剂在治疗组织损伤、糖尿病、衰老性疾病及神经退行性病变中凸显出优势。
[0007]本专利技术中选取的UC-MSCs能有效提高机体的免疫力，明显改善PD大鼠行为，修复大
脑受损神经元，可显著改善机体的抗氧化指标，其成本低，脐带来源充足，易于分离扩増培养，增殖能力强，UC-MSCs作为细胞移植的材料能适用于治疗临床常见的PD病。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法，建立稳定的PD大鼠模型，其成功率达到60％以上，探寻一种安全、有效的神经元保护性药物，通过UC-MSCs移植治疗改善PD大鼠行为学，修复PD大鼠多巴胺能神经元，用以增加PD大鼠TH+细胞数量，提高PD大鼠脑纹状体内多巴胺含量，降低氧化应激反应，以实现UC-MSCs治疗帕金森氏病的研究。
[0009]本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
[0010]一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法，具体包括以下方法步骤：
[0011]⑴
PD模型的构建
[0012]选取SPF级的SD大鼠，腹腔注射2％戊巴比妥进行麻醉，以前囟为标准参考点，选取坐标定位，将6-OHDA注射入大鼠MFB及右侧VTA区，Hamilton微量注射器在每点缓慢注射6-OHDA4μl，注射时间为5min，留针10min，术后腹腔注射青霉素5万U；
[0013]⑵
旋转行为学监测
[0014]脑立体定位建模后一周腹腔注射0.5mg/kg阿朴吗啡,连续监测8周，每次每只大鼠监测30min，计录30min内大鼠旋转的总圈数，大于平均7r/min，符合PD大鼠模型的旋转标准，即成功建立了帕金病氏PD大鼠模型；
[0015]⑶
UC-MSCs尾静脉移植治疗
[0016]⑷
组织取材
[0017]①
UC-MSCs移植治疗结束后，取全脑组织；
[0018]②
UC-MSCs移植治疗结束后，直接取新鲜脑组织；
[0019]⑸
免疫组化
[0020]通过脑图谱查找，以前囟为基准，切取-4.00mm～-7.00mm厚处的全脑组织进行切片染色，观察以获取免疫组化结果；
[0021]⑹
QRT-PCR检测黑质致密部TH的相对表达量
[0022]取50
㎎
冻存的直接取新鲜脑组织的中脑组织，提取的RNA，分别在260nm和280nm波长测定OD值；
[0023]按照逆转录试剂盒说明书操作，合成CDNA，按照
①
95℃30s，
②
95℃30s，
③
50℃30s，
④
72℃30s，
②
～
④
循环39次，每次结束后拍照，检测完成之后，进行数据统计和分析；
[0024]⑺
多巴胺含量、SOD活力及MDA含量检测。
[0025]而且，步骤
⑴
PD模型的构建中6-OHDA共设计2μg、5μg、10μg、15μg、20μg 5个梯度，选取的坐标点如下：
[0026]。
[0027]而且，6-OHDA的优选注射量为10μg，优选注射位点为AP:+0.7mm，MR:-3.0mm，DV:-4.5mm。
[0028]而且，UC-MSCs尾静脉移植治疗包括以下方法步骤：
[0029]①
UC-MSC细胞的分离培养：
[0030]获取无菌的脐带组织，在无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内的动脉和静脉，分离出脐带华通氏胶，并将其剪碎至1-5mm3，并以2-3mm的密度贴于T150cm2培养瓶的底面，培养1～4h后向培养瓶内添加适量DMEM/HAM
′
SF-12+10％FBS培养液进行培养，UC-MSCs覆盖率达到80％左右时，采用0.05％的胰蛋白酶对其进行消化，离心收集后，根据培养细胞的状态及收集细胞的细胞计本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法，其特征在于：具体包括以下方法步骤：
⑴
PD模型的构建选取SPF级的SD大鼠，腹腔注射2％戊巴比妥进行麻醉，以前囟为标准参考点，选取坐标定位，将6-OHDA注射入大鼠MFB及右侧VTA区，Hamilton微量注射器在每点缓慢注射6-OHDA4μl，注射时间为5min，留针10min，术后腹腔注射青霉素5万U；
⑵
旋转行为学监测脑立体定位建模后一周腹腔注射0.5mg/kg阿朴吗啡,连续监测8周，每次每只大鼠监测30min，计录30min内大鼠旋转的总圈数，大于平均7r/min，符合PD大鼠模型的旋转标准，即成功建立了帕金病氏PD大鼠模型；
⑶
UC-MSCs尾静脉移植治疗
⑷
组织取材
①
UC-MSCs移植治疗结束后，取全脑组织；
②
UC-MSCs移植治疗结束后，直接取新鲜脑组织；
⑸
免疫组化通过脑图谱查找，以前囟为基准，切取-4.00mm～-7.00mm厚处的全脑组织进行切片染色，观察以获取免疫组化结果；
⑹
QRT-PCR检测黑质致密部TH的相对表达量取50
㎎
冻存的直接取新鲜脑组织的中脑组织，提取的RNA，分别在260nm和280nm波长测定OD值；按照逆转录试剂盒说明书操作，合成CDNA，按照
①
95℃30s，
②
95℃30s，
③
50℃30s，
④
72℃30s，
②
～
④
循环39次，每次结束后拍照，检测完成之后，进行数据统计和分析；
⑺
多巴胺含量、SOD活力及MDA含量检测。2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法，其特征在于：步骤
⑴
PD模型的构建中6-OHDA共设计2μg、5μg、10μg、15μg、20μg 5个梯度，选取的坐标点如下：
。3.根据权利要求2所述的一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法，其特征在于：6-OHDA的优选注射量为10μg，优选注射位点为AP:+0.7mm，MR:-3.0mm，DV:-4.5mm。4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞应用于帕金森病治疗效果评价方法，其特征在于：UC-MSCs尾静脉移植治疗包括以下方法步骤：
①
UC-MSC细胞的分离培养：获取无菌的脐带组织，在无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内的动脉和静脉，分离出脐带华通氏胶，并将其剪碎至1-5mm3，并以2-3mm的密度贴于T150cm2培养瓶的底面，培养1～4h后向培养瓶内添加适量DMEM/HAM
′
SF-12+10％FBS培养液进行培养，UC-MSCs覆盖率达到80％左右时，采用0.05％的胰蛋白酶对其进行消化，离心收集后，根据培养细胞的状态及收集细胞的细胞计数活率，以8000～10000cells/cm2传至新的培养瓶中，继续培养；
②
UC-MSCs细胞制剂的制备：培养至P3代时，待细胞覆盖率达到85％时，将细胞消化后，300～400g/min，5～10min离心收集，进行细胞计数，用生理盐水将细胞浓度调整为1*106cells/ml，体重为500g的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳，楼敏铭，冯郸，马洁，
申请(专利权)人：天津市康婷生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：