一种瘦果遗传转化体系制造技术

本发明专利技术提供一种遗传转化体系及其构建方法，涉及采用瘦果构建转化体系。以草莓为例，证实了瘦果作为遗传转化体系可大幅提高转化效率，缩短基因功能验证的周期，是一种有前景的、从根本上不同于以往所有遗传转化体系的独特体系。体系。体系。

【技术实现步骤摘要】
一种瘦果遗传转化体系


[0001]本专利技术涉及一种遗传转化体系及其构建方法，涉及采用瘦果构建植物遗传转化体系，属于植物基因工程
本案是申请号为202010054750.2的分案申请。

技术介绍

[0002]通过基因工程技术改变植物的遗传性状是成熟的技术手段。在植物基因工程中，科研人员多采用叶片、叶柄、叶芽等为侵染对象，建立遗传转化体系。应用于植物上的基因导入法主要有农杆菌介导法，基因枪法和电击法。
[0003]众所周知，瘦果是一类非常特殊的种子。与其他种子不同(如颖果、坚果等)，瘦果的形体较小，果皮坚硬且较厚、不开裂、吸水透气性差、与种皮较易分离，内含一粒种子。由于瘦果与常规果实、叶片、根等常用试材的特性完全不同，因而研发人员通常不使用瘦果直接作为农杆菌侵染的对象，也无法借鉴之前对常用试材的常规处理方法或经验，如通过划刻叶片表面、注射或浸润果实等方式来侵染瘦果，难以想象采用何种条件转化瘦果才能获得稳定转化的好效果。
[0004]在园艺作物中，草莓的果实是由许多小瘦果聚生在肉质的花托上而形成的聚合瘦果，俗称草莓的“种子”。草莓属于蔷薇科草莓属的双子叶植物，具有优良的风味，抗氧化能力和巨大的商业价值。与栽培草莓相比，二倍体草莓具有更短的代周期，四季结果，更小的植株和更好的抗性，以及一些独特的风味特征，如强烈的香气。由于具有很多优良的品质，二倍体野生草莓成为草莓传统育种和现代分子育种的丰富资源。此外，由于二倍体林地草莓(Fragaria vesca，Hawaii 4)的完整基因组已经测序完成，草莓特别是二倍体草莓已经成为研究果实发育和成熟调控机制的常用材料。草莓也被认为是用于验证具有长生长周期的基因功能一个理想的实验材料。
[0005]然而，在草莓中，传统方法常用农杆菌介导的叶盘法；专利CN104388443A使用微注射的方法，将混合的菌液从草莓果实顶部注入；专利CN109517839A对草莓未开的花蕾进行侵染；基于植物细胞的全能性原理，专利CN109735538A采用组培苗的叶片，用刀片划出3-4条伤口，转移至农杆菌菌液中浸泡；专利CN106047921A同时用叶柄和叶片做外植体进行转化。这些方法均存在费时、工作量大或转化效率低等缺点。因此，目前研究人员普遍的共识是：对于现有的遗传转化方法，高频率的植株再生体系和有效的侵染与选择方式是获得遗传转化成功的关键。因此，李小红等(根癌农杆菌介导的草莓遗传转化研究进展，李小红，汤浩茹，生物技术通报，2006年第6期，第23-27页)建议应继续收集更广泛的不同基因型的草莓品种,来构建更有利于遗传转化的再生受体系统。同时，科研人员也更多着眼于优化上述例举的传统实验方案中的各种条件、筛选更易受感染的草莓品种等方面的研究。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种不同于以往技术的、全新的遗传转化体系及其构建方法，尤其是涉及一种采用瘦果构建的遗传转化体系。
[0007]据专利技术人所知，在植物基因工程领域，还没有关于瘦果遗传转化体系的相关报道，尤其是未见采用农杆菌侵染瘦果建立遗传转化体系的技术。
[0008]本专利技术以草莓瘦果为例，阐述本专利技术的核心思想和主要内容。本专利技术还详细描述了构建瘦果遗传转化体系的全过程，包括但不限于一些关键步骤以及最佳的实验方案。
[0009]可以理解，本专利技术构建瘦果遗传转化体系的方法不限于草莓瘦果，而是能够普遍适用于在任何具有瘦果的植物中，以瘦果为试材，进行农杆菌侵染的遗传转化方法；或者以瘦果为遗传转化的侵染对象的方法；或者以瘦果为侵染宿主的方法。
[0010]本专利技术的草莓遗传转化体系的构建方法，至少包括如下2个步骤：
[0011]获取草莓瘦果。优选的，还可以对获取的草莓瘦果进行消毒处理。
[0012]农杆菌侵染。优选的，萌发瘦果与侵染后的农杆菌进行共培养和/或抑菌培养。
[0013]优选的，所述瘦果在侵染前经过萌发；所述萌发的适宜度为瘦果萌出白色小尖，或采用萌出白色小尖的瘦果，或刚刚萌发出白色胚根的瘦果。优选的，萌发时间为7天或一周；优选的，萌发过程采用光暗交替培养；更优选的，培养环境为23士1℃。
[0014]在本专利技术的一个示例中，本专利技术的体系及构建方法采用成熟的草莓瘦果。
[0015]优选的，所述草莓为八倍体、四倍体或二倍体草莓等。
[0016]更优选的，所述草莓为森林草莓
‘
Hawaii-4
’
等；
[0017]优选的，农杆菌为根癌农杆菌；更优选的，农杆菌为GV3101、EHA105、或LBA4404等。
[0018]本专利技术的一个示例中，草莓瘦果的获取和消毒采用已知的常规方法。
[0019]优选的，瘦果的获取方法为：取成熟的草莓果实，剪取适合的纱布，用纱布将草莓包裹住，边揉搓边流水冲洗，直到无果浆流出，自然阴干，第二天揉搓纱布，果肉与瘦果自然分开，收集瘦果于2ml离心管中备用。优选的，草莓瘦果的消毒方法为：取成熟的草莓瘦果，在超净工作台上将瘦果放于培养皿中，用1％的次氯酸钠浸泡10min，隔2min用1ml的移液枪吸打，或者摇晃均可，之后用无菌水洗3次，无菌滤纸吸干待用。
[0020]本专利技术的一个示例中，草莓瘦果在侵染前经过萌发培养。优选的，萌发过程采用光暗交替培养；更优选的，光暗周期为16h/8h；优选的，光照强度为30000LX(250μmol
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m-2
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s-1)；更优选的，培养环境为23士1℃。
[0021]本专利技术的一个示例中，瘦果在侵染前经过萌发；所述萌发的适宜度为瘦果萌出白色小尖，或采用萌出白色小尖的瘦果，或萌发培养7-10天的瘦果，或初步萌芽的瘦果，或刚刚萌发出白色胚根的瘦果。
[0022]优选的，瘦果在侵染前进行萌发培养的时间为7天或一周。
[0023]本专利技术的一个示例中，农杆菌侵染的条件为：采用摇床(28℃，180rmp)，侵染18h。
[0024]本专利技术的一个示例中，草莓瘦果在与农杆菌共培养过程中采用避光或黑暗培养。优选的，于24℃共培养3-4天。
[0025]优选的，共培养中采用瘦果萌发培养基。
[0026]本专利技术的一个示例中，抑菌培养过程中经过采用光暗交替培养；优选的，光暗周期为16h/8h；优选的，光照强度为30000LX(250μmol
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m-2
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s-1)。
[0027]在一个实施例中，瘦果萌发培养基FG，包括的成分有：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L。
[0028]在一个实施例中，抑菌培养培养基FT，包括的成分有：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖
20g/L，琼脂8g/L，200mg/L特美汀。
[0029]在一个实施例中，农杆菌培养基LB，包括的成分有：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，抗生素浓度：利福平(20μg/ml),庆大霉素(50μg/ml),壮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种遗传转化体系，其特征在于，包括以植物的瘦果为转化的材料。2.如权利要求1所述的体系，其特征在于，还包括对瘦果进行侵染的农杆菌，优选的，侵染时间为18小时或24小时。3.如权利要求1或2的体系，其特征在于，所述植物为蔷薇科植物，优选的，为草莓属植物。4.如权利要求1-3之一所述的体系，其特征在于，所述瘦果在侵染前经过萌发；优选的，所述萌发的适宜度为瘦果萌出白色小尖。5.一种遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1>收集植物的瘦果；2>用农杆菌侵染瘦果。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈元月，黄芸，谷晓娇，许鹏昊，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：