一种制备BM-MSCs条件培养基的方法、条件培养基以及应用技术

本发明专利技术提供了一种制备BM－MSCs条件培养基的方法、条件培养基以及应用，方法包括(1)将PHD2

【技术实现步骤摘要】
一种制备BM-MSCs条件培养基的方法、条件培养基以及应用
[0001]本研究得到国家自然科学基金(No.81300279、81741067)、广东省自然科学基金(No.2016A030313815、2017A030313464)、广东省科学技术项目(No.2015A020212029)，广州市科学技术项目(No.201707010419、201804010050)、广东省中医药局科研项目(No.20201009、20201010)、高水平医院建设项目(登峰计划)(No.DFJH201803、KJ012019099)资助。


[0002]本专利技术属于生物
，具体涉及一种沉默PHD2制备高效表达旁分泌作用的BM-MSCs条件培养基的方法、条件培养基以及应用。

技术介绍

[0003]NEC(Necrotizing enterocolitis)是新生儿最常见的胃肠道急重症，见于7％-10％的早产儿，死亡率高达20-50％，NEC确切发病机制未明，目前尚无理想的治疗方法，20％-40％病例需要手术切除坏死肠道，幸存者常需面临短肠综合征等终身伴随的后遗症。
[0004]虽然进行了长达几十年的研究，NEC仍然是早产儿发病和死亡的主要病因。
[0005]干细胞疗法可能是治疗NEC最有前景的方法之一。干细胞抑制炎症和组织修复的能力引起了人们对治疗NEC的极大兴趣，有报道称，干细胞可修复不同类型的小肠损伤。干细胞的修复作用不仅表现在干细胞迁移和植入受损组织，更重要的是，干细胞还分泌多种效应分子，如生长因子、免疫调节因子、含RNA的胞外囊泡(EVs)等，以促进组织的恢复。
[0006]虽然骨髓间充质干细胞疗法可能是干细胞移植的一种可行的替代方案，但干细胞移植往往因为移植效率低和潜在的肿瘤发生率受阻，因此在其临床应用之前必须解决的一个主要问题是旁分泌物质中的活性因子浓度过低。研究已经表明，间充质干细胞(MSCs)释放的旁分泌因子不足以修复缺血性损伤和/或小肠粘膜损伤。解决该问题的一种方法是对MSCs的关键基因进行修饰，以增强MSCs中活性因子的分泌。现有技术中曾尝试修饰AKT、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)等基因以增强MSC旁分泌的效果，但多项临床研究还表明单一的血管生成因子的表达可能不足以促进血管新生并修复组织损伤。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种沉默PHD2制备高效表达旁分泌作用的BM-MSCs条件培养基的方法、条件培养基以及应用，以增强骨髓间充质干细胞旁分泌的效果。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种沉默PHD2制备高效表达旁分泌作用的BM-MSCs条件培养基的方法，方法包括以下步骤：
[0009](1)将PHD2
·
shRNA构建到慢病毒基因转移载体pGCSIL-GFP上；
[0010](2)在感染复数(MOI)为10下，用含shPHD2-GFP的慢病毒转染BM-MSCs；
[0011](3)通过检测PHD2蛋白表达确定稳定转染的BM-MSCs，进行细胞分选富集，然后将其在新的无血清基础培养基中培养48小时，得到含有BM-MSCs高效表达旁分泌物质的基础条件培养基；
[0012](4)将基础条件培养基进行超滤浓缩50倍，控制截留分子量为5kDa，得到浓缩条件培养基，然后将得到的条件培养基在零下20℃进行储存；
[0013]其中，步骤(3)中得到的基础条件培养基中，1mL非浓缩条件培养液相当于1.5～2.5
×
105BM-MSCs分泌量。
[0014]根据本专利技术的另一种具体实施方式，步骤(1)中采用的PHD2的基因序列为GenBank ID：XM_008772679。
[0015]根据本专利技术的另一种具体实施方式，所述的无血清基础培养基为DMEM-F12培养基。
[0016]另一方面，本专利技术提供了一种采用前述高效表达旁分泌效果的大鼠BM-MSCs条件培养基的方法所制备的条件培养基，其中，条件培养基中含有BM-MSCs高效表达的旁分泌物质。
[0017]根据本专利技术的另一种具体实施方式，条件培养基至少含有4000～4500pg/ml的IGF-1。
[0018]根据本专利技术的另一种具体实施方式，条件培养基至少含有500～600pg/ml的TGF-β2。
[0019]再一方面，本专利技术提供了一种沉默PHD2增强骨髓间充质干细胞的旁分泌作用在治疗NEC的药物中的应用。
[0020]本专利技术具备以下有益效果：
[0021]本专利技术所制备的BM-MSCs条件培养基，能够显著增强旁分泌作用的表达机制，这些旁分泌物质对NEC具有良好的修复作用，能够用作新的干细胞治疗NEC的策略。
[0022]下面结合附图对本专利技术作进一步的详细说明。
附图说明
[0023]图1显示了用shPHD2-GFP慢病毒转导的BM-MSCs特异性降低PHD2表达；其中，图1A显示了所建立的体内和体外实验流程，图1B显示了用含有GFP或shPHD2-GFP载体的慢病毒转染BM-MSCs，图1C显示了shPHD2能特异性降低PHD2蛋白表达，但不影响PHD1和PHD3蛋白表达，图1D流式细胞术分析显示PHDMSC对CD29、CD44呈阳性反应，而对CD34、CD45呈阴性反应，表明基因转染过程没有改变MSC的表型；
[0024]图2显示了PHDMSC-CM通过减少肠道结构和功能损害来改善NEC大鼠的生存率和发病率，其中图2A、2B分别显示了PHDMSC-CM治疗后显著提高了NEC大鼠存活率、降低了NEC的发病率的情况，图2C显示了PHDMSC-CM治疗后NEC幼鼠的出生后生长迟缓现象明显改善并出现了体重增加的情况，图2D显示了PHDMSC-CM治疗的NEC幼鼠回肠损伤明显减轻的情况(从左到右依次为：大体观、显微镜下、电镜下)；图2E、2F显示了PHDMSC-CM治疗后NEC鼠损伤肠通透性(血浆D-乳酸水平)和肠动力(亚甲基蓝迁移率)得到明显改善的情况；
[0025]图3显示了PHDMSC-CM在体内和体外减少NEC大鼠肠上皮细胞凋亡情况，其中，图3A显示了在生后第4天，PHDMSC-CM而非MSC-CM能够降低NEC大鼠肠道TUNEL阳性细胞数量，图
3B、3C、3D分别显示了与PHDMSC-CM共培养而非MSC-CM能保护损伤IEC-6细胞免于凋亡的情况(第3天)，图3E显示了与DMEM-F12组相比PHDMSC-CM共培养后第3、5、7天均能显著降低IEC-6细胞凋亡情况；
[0026]图4显示了PHDMSC-CM在体内和体外增加大鼠肠上皮细胞的增殖情况，其中，图4A显示了PHDMSC-CM组在第4天的肠道PCNA阳性细胞数量显著高于MSC-CM组和NEC损伤组，图4B显示了PHDMSC-CM组在第1、4、7天肠道的PCNA阳性细胞数量均高于MSC-CM组和NEC损伤组，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沉默PHD2制备高效表达旁分泌作用的BM-MSCs条件培养基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将PHD2
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shRNA构建到慢病毒基因转移载体pGCSIL-GFP上；(2)在感染复数(MOI)为10下，用含shPHD2-GFP的慢病毒转染BM-MSCs；(3)通过检测GFP荧光及PHD2蛋白表达确定稳定转染的BM-MSCs，进行细胞分选富集，然后将其在新的无血清基础培养基中培养48小时，得到含有BM-MSCs高效表达旁分泌物质的基础条件培养基；(4)将基础条件培养基进行超滤浓缩50倍，控制截留分子量为5kDa，得到浓缩条件培养基，然后将得到的条件培养基在零下20℃进行储存；其中，步骤(3)中得到的基础条件培养基中，1mL非浓缩条件培养液相当于1.5～2.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩，沙卫红，骆昱均，马发鑫，李金亮，郭科航，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：