高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法，所述方法包括：将重组抗EGFR单克隆抗体的种子细胞复苏，在Actipro基础培养基中放大培养后得到种子细胞培养悬液，将所述种子细胞培养悬液接种，发酵培养，定期流加补料培养基和葡萄糖溶液，培养至细胞活率低于80％，收获发酵培养液，得到所述高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞培养液。本发明专利技术方法筛选高效分泌表达抗EGFR抗体的敲除岩藻糖转移酶基因的CHO细胞系，使所表达的蛋白无岩藻糖修饰，以增强重组抗EGFR单抗的ADCC作用，增强其抗肿瘤效果，扩大适用人群。扩大适用人群。扩大适用人群。

【技术实现步骤摘要】
高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，具体涉及一种高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法。

技术介绍

[0002]EGFR是一种相对分子质量为170kDa的跨膜糖蛋白，属于HER/ErbB受体家族的酪氨酸激酶型受体。EGFR可以与表皮生长因子(EGF)、组织生长因子(TGF-α)等多种配体结合，二者结合后会使EGFR发生二聚化形成同源或异源二聚体，形成的二聚体发生交联磷酸化反应，即一个受体使另外一个受体上特定酪氨酸残基磷酸化，从而激活胞内区的酪氨酸激酶亚区，进而激发下一级信号传导。EGFR的信号传导关乎细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。EGFR在75％的结直肠癌(CRC)患者体内都存在过表达，并且与预后不良相关，使其成为单克隆抗体治疗的有吸引力的靶标。
[0003]目前，全球范围内批准的抗表皮生长因子受体的单抗类药物主要有西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗，其中西妥昔单抗商品名爱必妥，是一种重组的人鼠嵌合型IgG1单抗，由SP2/0杂交瘤细胞表达，但SP2/0杂交瘤细作为宿主细胞表达的抗体含非人源“α(1,3)半乳糖结构”，临床上发生严重的过敏反应，且西妥昔单抗在KRAS突变肿瘤患者中的作用不甚理想。一些证据表明，增强ADCC作用可直接提高该单抗的临床疗效。
[0004]ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用的改善可以通过使用具有糖基化修饰或Fc-结构域氨基酸序列改变的IgG来实现。体内外研究证实核心岩藻糖是影响ADCC活性最重要的糖基化结构。已有研究进一步证实与含有核心岩藻糖结构的单抗相比，无核心岩藻糖基化结构的单抗具有相对较高的FcγRIIIa结合能力及ADCC活性。
[0005]目前，在实际生产过程中，大约有90％由CHO细胞表达的重组IgG的Fc段都含有核心岩藻糖，为了提高抗体与FcγRIIIa之间的结合能力以及ADCC活性，采用多种方法降低重组IgG的岩藻糖基化修饰水平，包括采用敲除α-1,6岩藻糖基转移酶基因或者使其低表达的细胞株，或者采用GnTIII高表达的细胞株(添加二分支N乙酰葡糖胺转移酶会使核心岩藻糖含量下降)进行IgG的生产。

技术实现思路

[0006]为此，本专利技术实施例提供一种高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法，以解决现有技术中重组抗EGFR单克隆抗体细胞的表达量较低、所表达的抗体蛋白存在岩藻糖修饰的问题。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法，其特征在于，
[0009]所述方法包括：将重组抗EGFR单克隆抗体的种子细胞复苏，在Actipro基础培养基中放大培养后得到种子细胞培养悬液，将所述种子细胞培养悬液发酵培养，定期流加补料培养基和葡萄糖溶液，培养至细胞活率低于80％，收获发酵培养细胞，得到所述高效表达抗
EGFR单克隆抗体细胞。
[0010]优选的，所述发酵培养条件为：
[0011]在生物反应器中培养，初期培养温度为37℃，pH值为7.0～7.2，培养液的溶氧量为40％～60％，转速为150-250rpm，从发酵培养的96
±
2h开始，将培养温度调至32-34℃，并添加补料培养基，发酵时间为13-15天，得到细胞培养发酵液。
[0012]优选的，所述补料培养基为CellBoost 7a/7b。
[0013]优选的，所述流加补料培养基是在发酵培养第4-12天中，隔天流加，流加次数为4-5次，流加比例为3-5％。
[0014]优选的，所述流加补料培养基的流加次数为5次，第4、6、8、10、12d分别流加初始细胞培养液体积的3％、4％、5％、4％、3％。
[0015]优选的，所述葡萄糖溶液的流加量为保持所述发酵液中葡萄糖的质量浓度为2-8g/L。
[0016]优选的，所述种子细胞培养悬液制备过程为：
[0017]将重组抗EGFR单克隆抗体的种子细胞取出后，在37℃水浴融化，离心留取沉淀，用基础培养基重悬培养；
[0018]其中，培养箱的转速100rpm，温度为37℃，空气中CO2体积浓度为5％，每隔48-72h进行传代培养，经过2级传代培养后，得到所述种子细胞培养悬液。
[0019]优选的，所述发酵培养过程中，发酵培养开始时，所述种子细胞培养液的细胞密度为0.5-1.0
×
106个/mL。
[0020]本专利技术实施例具有如下优点：
[0021]本专利技术筛选高效分泌表达抗EGFR抗体的敲除岩藻糖转移酶基因的CHO细胞系，使所表达的蛋白无岩藻糖修饰，以增强重组抗EGFR单抗的ADCC作用，增强其抗肿瘤效果，扩大适用人群。
[0022]本专利技术在摇瓶培养阶段筛选多种培养基，选取无裂峰形成的培养基，并在此基础上进一步研究了该抗EGFR单克隆抗体细胞株的大规模细胞培养方法。
[0023]本专利技术培养方法全程采用无血清悬浮培养，摇瓶复苏，扩增后转入发酵罐培养，工艺流程简单，适合工业化生产。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0025]图1为本专利技术实施例1细胞的培养天数和活率变化曲线图；
[0026]图2为本专利技术实施例1获得的抗体还原CE-SDS电泳图；
[0027]图3为本专利技术实施例2细胞的培养天数和活率变化曲线图；
[0028]图4为本专利技术实施例2获得的抗体还原CE-SDS电泳图；
[0029]图5为本专利技术实施例3细胞的培养天数和活率变化曲线图；
[0030]图6为本专利技术实施例3获得的抗体还原CE-SDS电泳图；
[0031]图7为本专利技术实施例的不同细胞培养基条件下抗体重链裂峰情况，其中，A为Actipro细胞发酵培养液纯化抗体还原CE-SDS电泳图，B为Hycell细胞发酵培养液纯化抗体还原CE-SDS电泳图，C为Rapid CHO 18细胞发酵培养液纯化抗体还原CE-SDS电泳图。
具体实施方式
[0032]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0033]本专利技术中，溶氧量是采用百分饱和度表示法，将标定时溶解氧定为100％，零氧时为0％，则反应过程中的溶解氧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法，其特征在于，所述方法包括：将重组抗EGFR单克隆抗体的种子细胞复苏，在Actipro基础培养基中放大培养后得到种子细胞培养悬液，将所述种子细胞培养悬液发酵培养，定期流加补料培养基和葡萄糖溶液，培养至细胞活率低于80％，收获发酵培养细胞，得到所述高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞。2.如权利要求1所述高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：在生物反应器中培养，初期培养温度为37℃，pH值为7.0～7.2，培养液的溶氧量为40％～60％，转速为150-250rpm，从发酵培养的96
±
2h开始，将培养温度调至32-34℃，并添加补料培养基，发酵时间为13-15天，得到细胞培养发酵液。3.如权利要求1所述高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法，其特征在于，所述补料培养基为CellBoost 7a/7b。4.如权利要求1所述高效表达抗EGFR单克隆抗体细胞的筛选培养方法，其特征在于，所述流加补料培养基是在发酵培养第4-12天中，隔天流加，...

【专利技术属性】
技术研发人员：于红阳，申阳阳，王红丽，胡桂珍，杨仲璠，徐明波，
申请(专利权)人：北京双鹭立生医药科技有限公司北京双鹭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：