二咖啡酰基奎尼酸类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及二咖啡酰基奎尼酸类的应用，具体涉及二咖啡酰基奎尼酸类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术采用趋化因子受体CXCR3激动剂高通量筛选模型，通过功能性验证寻找先导化合物，发现了一类二咖啡酰基奎尼酸类CXCR3激动剂，为新型的抗肿瘤药开发提供先导化合物。本发明专利技术可为此类临床抗肿瘤治疗药物的开发提供先导化合物，为新型抗肿瘤药物开发提供线索和实验依据。提供线索和实验依据。提供线索和实验依据。

【技术实现步骤摘要】
二咖啡酰基奎尼酸类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用


[0001]本专利技术涉及二咖啡酰基奎尼酸类化合物的应用，具体涉及二咖啡酰基奎尼酸类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术介绍

[0002]趋化因子受体3(CXCR3)是G蛋白偶联受体家族成员之一，属CXC趋化因子受体家族，也称GPR9和CD183，主要与G蛋白α亚型偶联发挥作用。CXCR3受体的异构体包括CXCR3A，CXCR3B及CXCR3-alt，其天然配体有CXCL9(MIG)，CXCL10(IP-10)，CXCL11(I-TAC)。
[0003]肿瘤通常包含着不同的细胞类型，包括癌症相关性成纤维细胞，平滑肌细胞，内皮细胞和肿瘤浸润淋巴细胞等，这些细胞浸泡在细胞因子的动态混合物中，共同组成肿瘤微环境。肿瘤微环境是与肿瘤的发生、生长及转移密切相关的，因此肿瘤微环境的免疫反应对肿瘤的发生，发展及治疗具有重要的作用。CXCR3作为一种趋化因子受体，能够通过PI3K-AKT及MAPKs等细胞内信号途径发挥不同的生物学功能，包括调控血管的生成，细胞的增殖，凋亡，活化和浸润等，CXCR3广泛表达于各种组织和细胞，主要集中于Th1淋巴细胞和NK细胞等免疫细胞，也表达于肿瘤细胞及内皮细胞，其在免疫调节及抗肿瘤方面具有重要的调控作用。
[0004]目前研究认为CXCR3受体激动剂与多种细胞表面相应受体结合，CXCR3在黑色素瘤和结肠癌细胞转移到淋巴结和乳腺癌细胞转移到肺的转移中起重要作用，并且CXCR3激动剂CXCL9，CXCL10和CXCL11能够通过募集免疫细胞于肿瘤微环境产生抗肿瘤作用，因此，局部施用CXCR3激动剂可能在特定情况下能展现良好的效果。在免疫调节方面CXCR3能够调节Th1淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及树突状炎性细胞等免疫细胞浸润、增殖及活化。所以建立CXCR3激动剂筛选模型对治疗肿瘤和免疫相关性疾病具有重要意义。

技术实现思路

[0005]专利技术目的
[0006]本专利技术首次通过筛选发现已知化合物-二咖啡酰基奎尼酸类化合物的新用途。
[0007]技术方案
[0008]本专利技术的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染趋化因子受体CXCR3，建立CXCR3靶向激动剂高通量筛选模型，初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具有抗肿瘤作用的候选药物。具体步骤如下：
[0009]步骤一：建立及培养稳定转染趋化因子受体3的CHO细胞株。
[0010]步骤二：激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的EC
50
。
[0011]步骤三：采用稳转细胞株和实验确定的最佳检测条件对化合物进行趋化因子受体3激动剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。
[0012]筛选获得一类二咖啡酰基奎尼酸类化合物作为趋化因子3受体激动剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：二咖啡酰基奎尼酸类化合物为如下结构之一
[0013][0014]有益效果：
[0015]本专利技术采用趋化因子受体CXCR3激动剂高通量筛选模型，通过功能性验证寻找先导化合物，发现了一类二咖啡酰基奎尼酸类CXCR3激动剂，为新型的抗肿瘤药开发提供先导化合物。本专利技术可为此类临床抗肿瘤治疗药物的开发提供先导化合物，为新型抗肿瘤药物开发提供线索和实验依据。
附图说明：
[0016]图1：激动剂量效曲线
[0017]图2：先导化合物AF-p1量效曲线
[0018]图3：先导化合物AF-p2量效曲线
具体实施方式
[0019]AF-p1和AF-p2购自成都普瑞法。
[0020]实施例1
[0021]1.实验材料
[0022](1)完全培养：(Ham
‘
s F 12 nutrient medium；10％FBS；100U/mL Penicillin；
[0023]100μg/mL Streptomycin。
[0024](2)Stimulation Buffer(SB)：含1mM IBMX的F12。
[0025](3)主要仪器：CO2培养箱；384孔板；Paradigm
TM Detection Platform。
[0026]2.建立及培养稳定转染趋化因子受体3的CHO-K1/Gα15/Hcxcr3细胞株。
[0027]3.最佳细胞数确定
[0028](1)配制Forskolin梯度稀释液：需要用Forskolin对细胞进行刺激，所以应将Forskolin储备液逐级稀释为最终浓度的2倍(如表1)
[0029]表1.Forskolin稀释方法
[0030][0031](2)配制不同浓度的细胞稀释液：用SB将1.(7)中重悬好的细胞分别稀释为500cells/μL及1000cells/μL。
[0032](3)加样：将3.(1)中稀释好的Forskolin溶液按每个浓度2个复孔，5μL每孔加入384孔板中，再加入2孔每孔各5μL的SB作为cell negative control(CNC)。接着向不同浓度的Forskolin溶液及CNC中加入3.(2)配制好的不同浓度的细胞稀释液各5μL。将384孔板在500rpm下离心15s，使10μL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育45min。
[0033](4)终止试剂：用Lysis buffer(LB)将cAMP-d2稀释40倍，将anti-cAMP稀释20倍。取适量LB与稀释好的anti-cAMP溶液按1：1混合，向CNC中每孔各加入10μL；将剩余cAMP-d2溶液与anti-cAMP溶液按1：1混匀后加入到其余各孔，每孔10μL。将384孔板在500rpm下离心15s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育60min。
[0034](5)检测：孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm
TM Detection Platform上检测。处理数据，确定最佳细胞数及Forskolin的EC
80
。
[0035]4.激动剂筛选模型建立及阳性药验证，确定激动剂的EC
50
：
[0036](1)CXCR3激动剂I-TAC使用DMSO配制成500μg/mL储备液，因CXCR3偶联Gαi，需加入Forskolin刺激cAMP产生。首先根据3.(5)中Forskolin的EC
80
配制FSB，再用FSB逐级稀释为最终浓度的2倍(如表2)。
[0037]表2.I-TAC稀释方法
[0038][0039](2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将细胞稀释为3.(5)中得到的最佳细胞浓度。
[0040](3)加样：将4.(1)中稀释好的I-TAC溶液按每个浓度2个复孔，5μL每孔加入384孔板中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.二咖啡酰基奎尼酸类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：安晓飞，袁杨刚，孙庆敏，张继生，严明，
申请(专利权)人：安晓飞，
类型：发明
国别省市：