光敏性化合物及其制备方法和应用及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶技术

本发明专利技术公开了一种光敏性化合物及其制备方法和应用及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶。光敏性化合物的结构式如式(I)所示，其中，R为吸电子基团。该光敏性化合物的制备方法，包括以下步骤：将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于有机溶剂中，向其中加入含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺，搅拌回流反应10～20h后进行纯化处理得到所述光敏性化合物。光敏性化合物是以四氮唑环为光敏基团，光敏性蛋白质固定凝胶包括作为光敏成分的此化合物；将蛋白质分离功能和蛋白质固定功能集合于一体，可实现在凝胶内部原位固定蛋白质，稳定固定蛋白质，更加强力高效，不易被洗脱造成蛋白质损失。失。失。失。

【技术实现步骤摘要】
光敏性化合物及其制备方法和应用及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶


[0001]本专利技术涉及化学生物
，具体涉及一种光敏性化合物及其制备方法和应用，以及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶。

技术介绍

[0002]在肿瘤研究领域，肿瘤细胞本身具有高度异质性，癌症的靶向治疗需在单细胞分辨率水平上提供定量和高度特异性的靶蛋白检测。对细胞异质性的研究，可以为个体化的治疗提供丰富的，关键的遗传表达信息，为治疗方案的制定和靶向药物的选择和开发打下基础。在干细胞研究领域，研究不同细胞的基因表达差异有助于加深对遗传发育以及不同组织和细胞基因表达调控的规律的理解。蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者；同时，乙酰化、泛素化、磷酸化等表观遗传修饰对蛋白质的功能起着至关重要的调控作用。基因组及转录组的研究并不能满足人类对疾病发生发展中存在的异质性探索的需求，单细胞蛋白质组学应运而生。
[0003]目前，微流控芯片技术、荧光流式细胞术、质谱流式细胞术、质谱流式成像技术、单细胞分泌蛋白测定技术、单细胞蛋白质免疫印迹等高通量、高灵敏度、高分辨率的分析手段，为单细胞组学的研究提供了强有力的工具。其中，蛋白质免疫印迹(Western Blot)是细胞与分子生物学和免疫遗传学中常用的一种蛋白测定方法。具体流程是通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后将蛋白质转移到固相支持物上(如，硝酸纤维素或PVDF)，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体来检测样品中的蛋白质。由于蛋白质是经过电泳分离后再进行抗体结合反应，故较少受到抗体交叉反应性的影响。因此，即使在复杂的样品如细胞裂解物中，也能够清楚地区分靶上和靶外信号。
[0004]然而，传统的蛋白印迹方法中所测定的结果是基于大量细胞样品的蛋白平均表达水平，其结果掩盖了单个细胞蛋白的表达量的特殊性和多样性。由于抗原和抗体之间的结合存在着一定程度的特异性，仅仅依赖于抗原抗体的结合识别靶蛋白分子进行检测的蛋白免疫测定方法，如微流控技术、荧光流式细胞术、质谱流式细胞术、质谱流式成像技术、单细胞分泌蛋白isoplex技术等，特异性较低，可能存在较高的假阳性；同时也受到特异性探针的种类的限制而使得上述方法的应用受限。而且，考虑到对细胞表面蛋白、跨膜蛋白、分泌蛋白及胞内甚至核内蛋白的检测，在流式细胞术中，胞内及核内蛋白的直接检测操作难度大；单细胞分泌蛋白检测技术仅可检测分泌蛋白，无法检测细胞表面、跨膜蛋白、胞内及核内蛋白。
[0005]单细胞蛋白质免疫印迹结合了十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)的分子筛效应和免疫印迹的特异性，通过蛋白质的分子量和抗原抗体识别双重验证，保证了检测的特异性，同时可检测细胞表面蛋白、跨膜蛋白、胞内及核内的蛋白，可区分经表观遗传修饰蛋白。但基于N-(3-[(4-苯甲酰基苯基)甲酰氨基]丙基)甲基丙烯酰胺的光敏感型凝胶，光敏固定效率较低，检测下限为单细胞27000个蛋白分子，难以应用于低丰度蛋白质的
检测，且背景荧光较高，方法灵敏度低。激发波长也较短(UVB，280～320nm)，可能引起蛋白抗原位点失活，造成假阴性。此外，难以应用于稀有细胞类群的单细胞蛋白质分析，例如，循环肿瘤细胞(1-10个细胞/毫升血液)。

技术实现思路

[0006]本专利技术为克服上述现有技术的不足，提供一种光敏性化合物及其制备方法和应用，以及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶。
[0007]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
[0008]一种光敏性化合物，其特征在于，所述光敏性化合物的结构式如式(I)所示：
[0009][0010]其中，R为吸电子基团。
[0011]优选地，所述吸电子基团选自取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的芳基。
[0012]优选地，所述吸电子基团选自如下基团的任意一种：
[0013][0014]本专利技术的另一个目的是，提供一种光敏性化合物的制备方法。
[0015]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
[0016]光敏性化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0017]将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于有机溶剂中，向其中加入含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺，搅拌回流反应10～20h后进行纯化处理得到所述光敏性化合物。
[0018]优选地，所述N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺的质量比为1:1:(2～8)。
[0019]优选地，所述含吸电子基团的四氮唑类化合物通过以下步骤制备：
[0020]A、将环状化合物溶解于有机溶剂中，于
–
40℃下加入二乙酸碘苯并在氮气保护下搅拌3～5h；将搅拌后的混合物经过浓缩处理后溶解于有机溶剂，再向其中加入5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺，于室温且氮气保护下搅拌至少24h后，进行洗涤、干燥、过滤及纯化处理，得到中间产物；
[0021]B、将所述中间产物溶解于体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下加入氢氧化锂；再于室温且氮气保护下搅拌至少1h；最后将其置于0℃下加入2N HCl，调节pH为7～9，得到混合溶液；
[0022]C、萃取出所述混合溶液中的有机相，然后进行洗涤处理、干燥剂干燥和过滤后即得到所述含吸电子基团的四氮唑类化合物。
[0023]优选地，所述环状化合物选自未经取代或取代的杂环化合物，或者未经取代或取
代的苯环。
[0024]优选地，在步骤A中，所述环状化合物、二乙酸碘苯和有机溶剂的摩尔比为1:(10～15):(100～200)；所述5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺的摩尔比为(3～8):1:(13～20)。
[0025]优选地，在步骤A中，采用硅胶层析进行纯化，其中洗脱剂PE:EA＝4～8:1。
[0026]优选地，在步骤B中，所述中间产物和氢氧化锂的质量比为1:1～5。
[0027]优选地，在加入所述含吸电子基团的四氮唑类化合物前，还需加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和1-羟基苯并三唑反应至少30min；其中加入的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和1-羟基苯并三唑与N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐的质量比为(2～7):(1～3):1。
[0028]优选地，所述含吸电子基团的四氮唑类化合物通过琥珀酰亚胺酯和含四氮唑基团的化合物制备得到，其中所述含四氮唑基团的化合物具有吸电子基团。
[0029]优选地，所述有机溶剂包括三氟乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
[0030]本专利技术的另一个目的是，还提供一种光敏性化合物的应用。
[0031]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
[0032]光敏性化合物或前述制备方法得到的光敏性化合物在分离和固定蛋白质中的应用。
[0033]本专利技术的另一个目的是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光敏性化合物，其特征在于，所述光敏性化合物的结构式如式(I)所示：其中，R为吸电子基团。2.根据权利要求1所述的光敏性化合物，其特征在于，所述吸电子基团选自取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的芳基。3.根据权利要求2所述的光敏性化合物，其特征在于，所述吸电子基团选自如下基团的任意一种：4.权利要求1～3任一项所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于有机溶剂中，向其中加入含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺，搅拌回流反应10～20h后进行纯化处理得到所述光敏性化合物。5.根据权利要求4所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，所述N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺的质量比为1:1:(2～8)。6.根据权利要求4所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，所述含吸电子基团的四氮唑类化合物通过以下步骤制备：A、将环状化合物溶解于有机溶剂中，于
–
40℃下加入二乙酸碘苯并在氮气保护下搅拌3～5h；将搅拌后的混合物经过浓缩处理后溶解于有机溶剂，再向其中加入5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺，于室温且氮气保护下搅拌至少24h后，进行洗涤、干燥、过滤及纯化处理，得到中间产物；B、将所述中间产物溶解于体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下加入氢氧化锂；再于室温且氮气保护下搅拌至少1h；最后将其置于0℃下加入2N HCl，调节pH为7～9，得到混合溶液；C、萃取出所述混合溶液中的有机相，然后进行洗涤处理、干燥剂干燥和过滤后即得到所述含吸电子基团的四氮唑类化合物。7.根据权利要求6所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，所述环状化合物选自未经取代或取代的杂环化合...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁显廷，谢海洋，张婷，李山鹤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：