一种预防或治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种预防或治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物及其制备方法与应用，脑缺血是对人类威胁最大的脑血管疾病，尽早建立再灌注会导致氧化损伤、炎症反应以及随后的兴奋毒性细胞死亡；本发明专利技术利用多巴胺在碱性的条件下被氧化形成多巴胺醌，而多巴胺醌进一步氧化形成具有超分子结构的聚多巴胺纳米粒子，形成的粒子表面光滑圆整,球形度较好，粒径分布较均匀,且在溶液中保持良好的分散状态，通过体外和体内实验，聚多巴胺纳米粒子证明了它的生物安全性，通过应用于脑缺血模型，表明其可减轻脑缺血再灌注损伤，抑制炎症反应，抑制NF

【技术实现步骤摘要】
一种预防或治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种预防或治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物及其制备方法与应用，属于药物制备领域。

技术介绍

[0002]脑卒中是一组急性脑循环障碍所致的局部或全面性脑功能缺损综合征，每年造成约620万人死亡，是全世界第2位致死原因、首位致残原因。脑卒中分为缺血性脑卒中及出血性脑卒中。缺血性脑卒中又称脑梗死，是脑卒中主要的表现形式，约占70～80％。TOAST分类系统将其分为大动脉粥样硬化性卒中、心源性脑栓塞、小动脉闭塞性卒中(腔隙性卒中)、其他明确病因型脑卒中和不明原因型脑卒中。出血性脑卒中又称颅内出血，虽然发病率低于缺血性脑卒中，但是预后差，其致残率和病死率均高于缺血性脑卒中，可发生于血压出现剧烈波动时。对于缺血性脑卒中的首要治疗原则是尽早重建血液再灌，恢复脑部的血氧供应，使缺血脑组织重新获得营养物质供应，同时将有害的代谢产物清除掉。但脑缺血后再灌注可加重缺血脑组织的病理损害，使病情恶化，这种现象被称为脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury,CIRI)。针对CIRI的病理机制，世界各国的科技工作者进行了广泛而深入的研究，提出了能量代谢障碍、钙超载、兴奋性氨基酸毒性、线粒体损伤、一氧化氮大量合成、炎症损伤、氧化应激、多巴胺和神经细胞凋亡等一系列学说；其中氧化应激损伤是近些年来研究的热点。当机体遭受有害刺激时，机体内产生的活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)介导的抗氧化防御和氧化损伤之间的平衡被打破，ROS在机体或细胞内蓄积，引起机体组织细胞的氧化损伤过程即为氧化应激。氧化损伤以及随后继发的炎症反应以及兴奋毒性细胞死亡，不仅严重影响神经元的修复和功能恢复，而且还会导致使更多的组织损伤和出血转化。缺血/再灌注后活化的小胶质细胞和星形胶质细胞增加了促炎细胞因子的分泌，进一步加重了血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的破坏，随后循环白细胞迁移至受伤部位。这些失调的中性粒细胞可能释放促炎性细胞因子，蛋白酶和活性氧(ROS)，继续引起组织损伤和功能障碍。因此，消除促炎细胞因子和活性氧以减少组织损伤可能是脑卒中的重要治疗手段之一。
[0003]由于溶栓取栓治疗时间窗较窄以及部分地区医疗条件的限制，仅有部分急性缺血性脑卒中患者可以接受溶栓取栓治疗，因此神经保护治疗有了更为广泛的前景和重大的意义。目前主要的神经保护药物包括了自由基清除剂、钙离子通道阻断剂、谷氨酸受体拮抗剂、镁剂、GABA受体激动剂、细胞膜稳定剂、神经节苷脂类药物等等。然而2018年的ASA/AHA指南并没有推荐使用神经保护剂，因为到目前为止，没有足够的证据来证明它们能改善缺血性中风后的临床转归。不过在实际的应用中，一些神经保护剂确实显示了它们在减轻氧化应激、扩张缺血区小动脉、促进患者康复等方面的作用。由多巴胺的自聚合反应而产生的聚多巴胺纳米颗粒(PDA NPs)具有许多独特的化学特性，在纳米医学领域引起了广泛的关注。聚多巴胺作为黑色素的主要成分，由于出色的生物相容性和生物可降解性，已广泛用于
药物输送，分子成像和癌症治疗。更重要的是，由于其结构中具有丰富的酚羟基，因此PDA具有出色的清除自由基的能力，并已被用作抗炎药来治疗包括急性腹膜炎和急性肺损伤在内的急性炎症性损伤。先前的研究已经证明PDA纳米颗粒可以降低ROS的水平并改善急性炎症，因此我们考虑是否将PDA应用于保护脑缺血再灌注损伤，并探究其与氧化应激和NF-κB信号通路等的作用关系。鉴于聚多巴胺纳米粒子出色的生物相容性和生物可降解性，倘若能进一步应用于脑血管疾病的治疗当中，将可能给该类患者的康复带来更多受益。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤纳米药物的制备，以解决现有技术中存在的问题。
[0005]本专利技术利用线栓法制造大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型，观察大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经功能损伤情况，然后给予不同的药物处理，观察大鼠脑组织梗死体积，大鼠神经功能评分、行为学及NF-κB信号通路、炎症细胞因子以及氧化应激水平的表达，并通过免疫荧光观察小胶质细胞的活化程度，以此探讨PDA纳米颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑内氧化应激和炎症水平的影响，以及对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的修复的影响。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]聚多巴胺纳米颗粒的制备，包括以下步骤：
[0008](1)配置弱碱性反应缓冲溶液
[0009]在敞口圆底烧瓶中先将8-10mL无水乙醇与18-20mL去离子水均匀混合，然后加入0.1-0.2mL氨水，在室温下使用磁力搅拌器搅拌20-30min，以配置氨水-乙醇混合溶液反应缓冲液。
[0010](2)多巴胺自聚合反应
[0011]称取质量为100mg盐酸多巴胺粉末加入预先配置好的氨水-乙醇混合溶液反应缓冲液25-30mL，并在室温下保持搅拌24-48小时，可发现溶液颜色逐渐由无色变成棕色，又逐渐变成黑色，当盐酸多巴胺在弱碱性溶液中经过24-48小时的自聚合反应后，溶液变为深黑色的PDA悬浮液。
[0012](3)PDA清洗、收集和表征
[0013]使用去离子水作为透析液，将生成的PDA悬浮液置于透析袋中透析48-72小时,并及时更换透析液，直至透析液澄清无色，且使用pH试纸测得pH值为中性。收集透析袋中PDA悬浮液，加入离心管中，以转速3000-5000rpm，在离心机中离心10-20分钟，将上清液(未参与反应的剩余物)去除，得到聚多巴胺纳米颗粒的混悬液，将聚多巴胺纳米颗粒的混悬液进行冷冻干燥，即可得到聚多巴胺纳米颗粒。
[0014]聚多巴胺纳米颗粒应用于制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物。
[0015]由于采用了以上技术，本专利技术较现有技术相比，具有的有益效果如下：
[0016](1)本专利技术合成的制备得到的聚多巴胺纳米颗粒，聚多巴胺纳米颗粒形成了均匀且单分散的球形结构，可以稳定分散再水溶液中，而没有明显的聚集。
[0017](2)本专利技术中在进行反应时，除了氢氧化铵和盐酸多巴胺这两种反应底物外，不添加其他催化剂，保证了制备得到的聚多巴胺纳米颗粒的安全性。
[0018](3)本专利技术合成的制备得到的聚多巴胺纳米颗粒，通过应用于脑缺血模型，表明其可减轻脑缺血再灌注损伤，抑制炎症反应，抑制NF-κB信号通路的活化、抑制小胶质细胞的过度激活，具有抑制脑部炎症反应和减轻脑缺血再灌注损伤的潜力。
附图说明
[0019]图1为PDA的表征图，其中，图A，B为透射电镜下聚多巴胺纳米颗粒图像，图C为分散的聚多巴胺纳米颗粒尺寸范围的直方图，粒径为193.39
±
21.12nm；
[0020]图2为各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酸(AST)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)含量的统计学差异图；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.聚多巴胺纳米颗粒在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备工艺如下：(1)将盐酸多巴胺与弱碱性反应缓冲溶液进行聚合反应，得到PDA悬浮液；(2)将生成的PDA悬浮液置于透析袋中进行透析后，将透析袋中的PDA悬浮液进行离心，去除上清液，冷冻干燥，即可得到聚多巴胺纳米颗粒。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(1)中聚合反应的时间为24-48小时。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(2)中透析的时间为48-72小时。5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(2)离心的转速为3000-5000rpm，离心的时间为10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，杨建军，纪木火，刘盼苗，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：