一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M

【技术实现步骤摘要】
一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母及其应用


[0001]本专利技术涉及一种C6/C5共发酵酿酒酵母及其应用，尤其涉及一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]木质纤维素类生物质是地球上最丰富的可再生能源，年产量超过10
13
吨。随着石化资源的日益枯竭和环境污染问题，发展以木质纤维素类生物质为原料的生物基能源技术是实现能源转型的重要措施之一，也是世界范围内新能源格局的重要部分。以木质纤维类生物质为原料，通过微生物细胞工厂转化生产清洁液体燃料和化学品，是生物基能源技术的重要路径。木质纤维素因其化学结构坚固致密难以被微生物直接利用，因而需对原料进行必要的水解处理以释放微生物可直接利用的糖类组分。然而，木质纤维素水解液的化学成分较为复杂，同时含有六碳糖、五碳糖等糖类组分，以及弱酸类、呋喃类和酚类等非糖组分抑制物。其中，非糖组分抑制物通常对发酵微生物的生长和代谢具有抑制作用。因此，依据木质纤维素水解液组分特点，发酵微生物在性能上必须具备两个特点，即高效的六碳糖/五碳糖共发酵能力和较高的抑制物鲁棒性。
[0003]二代燃料乙醇是以木质纤维素为原料生产的乙醇，是国际上公认的替代化石能源的理想液体燃料之一。作为乙醇生产的主要发酵微生物，酿酒酵母因其强大的己糖发酵能力、鲁棒性以及成熟的基因操作技术，被认为是转化木质纤维素水解产物生产燃料乙醇的最具潜力的工业菌株之一。然而，野生型酿酒酵母由于缺乏戊糖(例如木糖)代谢的关键途径，只有极其微弱的戊糖代谢能力。木糖是木质纤维素类生物质中含量第二高的戊糖，其能否高效利用是提高原料底物转化效率和燃料乙醇经济盈利性的关键环节之一。为了提高酿酒酵母的木糖利用能力，国内外科学家开展了大量的工作，主要包括：1)木糖代谢起始途径的异源引入，即木糖还原酶-木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径和木糖异构酶(XI)途径；2)木糖代谢内源途径代谢优化；3)细胞内辅因子代谢平衡优化；4)特异性高效木糖转运蛋白筛选；5)适应性进化工程等。经过研究者们的不懈努力，酿酒酵母的纯品木糖代谢能力已基本达到葡萄糖的代谢水平。虽然酿酒酵母具备了葡萄糖和木糖共利用的能力，但其对木质纤维素水解液中抑制物的抗性仍然较低，而抑制物鲁棒性亦是影响微生物生长和代谢效率的重要因素。近十年来，科学家通过改造细胞内抑制物抗性响应途径等理性改造策略，以及随机突变和适应性进化等非理性策略，在一定程度上提高了细胞对单一抑制物的抗性。然而，对存在于木质纤维素水解液中多种类抑制物的协同抑制效应，即使较低浓度的混合抑制物亦可表现出较强的抑制作用。在研究过程中，包括申请人团队在内的国内外研究者发现，酿酒酵母在提高抑制物抗性的同时，其木糖代谢能力出现了不同程度的下降，似乎这两种性状存在此消彼长的拮抗关系。因此，在细胞内同时获得高木糖代谢和高鲁棒性这两种特性对选育二代燃料乙醇生产菌株带来了不小的挑战。
[0004]申请人在前期工作中，基于牛瘤胃宏基因组中筛选得到高活性木糖异构酶和来自
Meyerozyma guilliermondii的特异性木糖转运蛋白MGT05196N360F，通过理性代谢工程及适应性进化工程构建了一株葡萄糖/木糖高效共利用重组酿酒酵母菌株，但其在含较高抑制物浓度的玉米秸秆水解液中鲁棒性较差。申请人实验发现在提高该菌株抑制物鲁棒性的研究中，鲁棒性提高的同时，木糖代谢明显下降，上面提到的拮抗关系再次出现。经检索，针对菌株中木糖代谢和鲁棒性之间的拮抗性，在酿酒酵母中目前有关消除或缓解这一拮抗性的专利和相关文献尚未见报道。

技术实现思路

[0005]针对目前二代燃料乙醇生产酿酒酵母菌株对木质纤维素水解液中混合抑制物抗性不足，以及菌株抑制物抗性与木糖代谢能力之间的拮抗现象，本专利技术要解决的问题是提供一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株及其应用。
[0006]本专利技术所述的能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母，其特征在于：该菌株同时具备抑制物高鲁棒性和高木糖利用的特性，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M-15，菌株已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCC No.20436。
[0007]上述酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M-15是通过常温常压等离子体(ARTP)迭代诱变，并结合在高毒性(含多种抑制物)玉米秸秆预处理液和纯木糖培养基中交替驯化和筛选获得的，具体技术步骤如下：
[0008](1)出发菌株在高毒性玉米秸秆预处理液中的生长测试：
[0009]出发菌株为申请人实验室前期构建的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株LF1，该菌株已申报专利，专利申请号：201510747241.7，保藏号：CGMCC No.11331。
[0010]高毒性玉米秸秆预处理原液(以下简称预处理液)中主要糖组分为葡萄糖和木糖(浓度分别为14g L-1
和43g L-1
)；主要抑制物为乙酸、5-羟甲基糠醛、糠醛及总酚类化合物(浓度分别为3.5g L-1
、2.7g L-1
、0.3g L-1
和3.3g L-1
)。
[0011]在YP培养基中添加不同比例的预处理液，考察其对菌株生长的影响。结果显示，预处理液添加比例为50％(v/v)时，菌株生长受到明显抑制，说明50％(v/v)预处理液中抑制物浓度能够对细胞造成显著的毒性。基于此，确定50％(v/v)预处理液的添加量可以作为后续筛选抑制物鲁棒性提高菌株的选择压力条件。
[0012](2)ARTP诱变处理：
[0013]首先，绘制出发菌株LF1经ARTP诱变的致死率曲线。然后，根据致死率对LF1进行诱变处理，诱变后的菌体置于YPD培养基中孵育30min恢复生长。最后，将菌体置于含50％(v/v)预处理液的YP培养基中连续驯化培养30天。
[0014](3)鲁棒性显著提高菌株的筛选：
[0015]取适量上述驯化后的菌体培养液，无菌水洗涤后涂布到含50％(v/v)预处理液的YP固体培养基进行培养。挑选直径较大的单菌落若干，通过Bioscreen全自动生长曲线分析仪测试上述菌落在50％(v/v)预处理液培养基中的生长能力。对生长较快的菌株于40mL的相同培养基条件下进行复筛，筛选得到鲁棒性最高的菌株，命名为LF1-6。
[0016](4)多轮ARTP迭代诱变缓解木糖利用和鲁棒性之间的拮抗现象：
[0017]筛选得到的菌株LF1-6鲁棒性显著提高，但其木糖利用能力下降。为恢复其木糖利用能力，通过多轮ARTP迭代诱变，在纯木糖固体培养基中厌氧培养，挑选生长较快的单菌落测试其木糖利用能力，最终获得一株明显缓解木糖利用与鲁棒性之间拮抗现象的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株，命名本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母，其特征在于：该菌株同时具备抑制物高鲁棒性和高木糖利用的特性，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M-15，菌株已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.20436。2.权利要求1所述能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母在以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料摇瓶发酵生产二代燃料乙醇的方法是：用玉米秸秆水解液代替YP培养基中的水，使发酵培养基中的组分及浓度是：20g L-1
蛋白胨、10g L-1
酵母粉、50.23
±
0.39g L-1
葡萄糖、25.62
±
0.47g L-1
木糖、0.93
±
0.13g L-1
纤维二糖、1.03
±
0.31g L-1
半乳糖、8.09
±
0.24g L-1
阿拉伯糖、4.36
±
0.28g L-1
乙酸、1.09
±
0.25g L-1 5-羟甲基糠醛、0.35
±
0.06g L-1
糠醛、4.78
±
0...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍晓明，赵建志，韦方卿，李洪兴，李在禄，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：