基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法技术

本发明专利技术属于植物分子鉴定技术领域，具体涉及基于一种杜氏藻核心基因序列进行品系鉴定的方法。该方法主要包括：样本搜集、纯化与培养；全基因组DNA提取；构建DNA测序文库；获取待测藻株和杜氏藻Dunaliella quartolecta全基因组测序数据；杜氏藻D.quartolecta核心基因组测序片段筛选与从头组装，对组装的核心基因组序列进行基因组分、蛋白功能注释及基因组重叠群共线性分析；利用单核苷酸多态性构建系统进化树，当待测藻株与四叶杜氏藻聚为一簇，且分支的数据支持率在0.99～1.00，遗传相似度百分比大于≥99％，待测藻株即为D.quartolecta。待测藻株即为D.quartolecta。待测藻株即为D.quartolecta。

【技术实现步骤摘要】
基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法


[0001]本专利技术属于植物分子鉴定
，具体涉及基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法。

技术介绍

[0002]杜氏藻Dunaliella quartolecta是一种生活在海洋、盐湖及其它极端环境的真核单细胞微藻，属绿藻门、绿藻纲、团藻目、盐藻科、杜氏藻属，抗逆性强，无细胞壁，含色素体和蛋白核，细胞顶端具鞭毛。杜氏藻D.quartolecta富含甘油、β-胡萝卜素、藻多糖等生物活性物质，属于特色经济微藻。以杜氏藻D.quartolecta中的特色品系作为生物反应器，对其活性物质进行提取及工业化生产，在食品加工、医疗保健、生物柴油等领域具有重要的应用前景。然而，目前国内外已被鉴定的杜氏藻属共23个种，形态相似且广谱耐盐，单从形态学角度对其中的杜氏藻D.quartolecta进行鉴定难度很大。从DNA标记、基因标记、蛋白标记的角度虽提高了藻株鉴定的效率，然而准确率仍然受到分子标记手段、片段的保守性及扩增或实验程序的非通用性等因素限制，一些近缘藻株的常规分子鉴定常会遇到候选扩增片段少、通用标记特异性差、新型标记及特异性引物开发周期长、PCR扩增程序仍需优化等缺点，获得的鉴定结果也往往存在假阳性。作为杜氏藻属中一类重要的高附加值特色品系，杜氏藻D.quartolecta资源的分子鉴定十分关键。因此，研发一种更精准、快速、通用的杜氏藻D.quartolecta分子鉴定方法很有必要。
[0003]由于下一代DNA测序技术的快速发展，基于物种全基因组水平的分子鉴定技术成为可能。较传统的分子鉴定技术，全基因组水平的鉴定遗传信息量更大，检测范围更广，对于近缘物种的鉴定更有效，可获取的遗传变异信息更丰富。目前，很多模式物种的全基因组测序数据已经公布。虽然盐生杜氏藻(D.salina)的参考基因组测序数据已于2017年公布(Dunsal1 v.2)，然而，作为另一种典型的嗜盐杜氏藻D.quartolecta，迄今仍未有该藻株全基因组测序工作的相关报道。利用当前流行的二代联合三代测序技术对物种进行全基因组测序，虽然能获得该物种较为完整的遗传信息，但仍存在以下几方面缺陷：(1)所有测序片段均须进行完全比对，运算耗时较长，数据量产出庞大，会消耗计算机大量的时间和资源，不利于分子鉴定工作的及时开展；(2)基因组组装及生物信息分析不仅高度依赖国内外测序公司的二代和三代高通量测序平台，如Illimina、Nanopore、PacBio等，而且受物种基因组大小及平台计算能力的限制，结果产出周期较长，造价较高，普通实验室往往难以承担；(3)对近缘物种进行分子鉴定，将高度依赖其全基因组重测序质量，而这又与参考物种基因组质量紧密相关，若参考物种基因组测序深度不够、组装质量不高，将影响待测物种基因组的重测序结果，进而导致物种鉴定出现偏差。
[0004]因此，如何提供一种准确、高效、经济的从待测藻株中鉴定杜氏藻D.quartolecta的方法是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]针对上述问题本专利技术提供了基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0007]基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法，包括以下步骤：
[0008](1)样本搜集、纯化与培养：采集待测藻株及杜氏藻D.quartolecta，将待测藻株经纯化后进行室内扩大培养；
[0009](2)全基因组DNA提取：利用改良的CTAB法分别提取待测藻株及杜氏藻D.quartolecta的全基因组DNA，冷冻保存；
[0010](3)将步骤(2)中的待测藻株及杜氏藻D.quartolecta的全基因组DNA打断、纯化后分别构建DNA测序文库；
[0011](4)采用高通量测序法对步骤(3)中的DNA测序文库分别进行测序，获取待测藻株和杜氏藻D.quartolecta全基因组二代测序数据；
[0012](5)以NCBI已公布的盐生杜氏藻全基因组数据为参考，将步骤(4)中获取的杜氏藻D.quartolecta全基因组测序数据与其进行比对，通过筛选、从头组装、质量评估后获得杜氏藻D.quartolecta核心基因组序列，该核心基因组序列大小为6592916bp，重叠群数量为3000个，最大重叠群长度为1133322bp，重叠群平均长度为2197.64bp，重叠群N50为15270，完整基因占比23.65％，单拷贝基因占比15.18％，多拷贝基因占比13.76％，空位/缺失占比1.89％，不完整片段占比17.45％，构建从头组装的杜氏藻D.quartolecta核心基因组环状图谱，然后对杜氏藻D.quartolecta核心基因组序列进行基因组分、蛋白功能注释及基因组重叠群共线性分析；
[0013](6)以步骤(5)中构建的杜氏藻D.quartolecta核心基因组序列为参考，将步骤(4)获得的待测藻株全基因组测序数据及已公布代表性藻类的基因组测序数据与其进行比对，检测物种间的单核苷酸多态性和插入/缺失位点，然后利用单核苷酸多态性构建系统进化树，当待测藻株与杜氏藻D.quartolecta聚为一簇，且分支的数据支持率在0.99～1.00，遗传相似度百分比大于≥99％，待测藻株即为杜氏藻D.quartolecta。
[0014]进一步，所述步骤(1)中室内扩大培养具体步骤为：对待测藻株藻细胞进行无菌条件下的单克隆挑取，显微镜检合格后在无菌条件下进行室内扩大培养，室内扩大培养条件为：光周期为18h：6h，光照强度为19000lx，温度：23
±
3℃，保持无菌通风环境，每隔5天对培养皿进行摇动以防藻细胞贴壁，并取0.5～1mL藻液进行镜检，培养周期为28
±
7天，配制下述培养基溶液对待测藻株进行室内扩大培养，培养基配方如下：
[0015]30g/L NaCl，1.5g/L NaNO3，1.4g/L K2HPO4，1.75g/L MgSO4
·
7H2O，1.36g/LCaCl2·
7H2O，1.2g/LNa2CO3，0.006g/L FeC6H5O7，0.005g/LNaH2PO4·
2H2O，0.5g/LCo(NO3)2·
6H2O，0.8g/LCuSO4·
5H2O，2.3g/LZnSO4·
7H2O，0.03g/LH3BO3，4.0g/LNa2MoO4·
2H2O，0.02g/LMnCl2·
4H2O，0.5g/LVB1，0.5g/LVB
12
，VH 0.5g/L，超纯水定容至1L。
[0016]进一步，所述步骤(2)中改良的CTAB法具体步骤为：取600～800mg待测藻株，用超纯水冲洗2～3次，4℃8000r/min离心1.5min，加液氮研磨15sec，加入800μL 20℃预热的2％W/V的CTAB溶液，1μL 1％V/V的β-巯基乙醇，混匀后在60本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样本搜集、纯化与培养：采集待测藻株及杜氏藻Dunaliella quartolecta株，将待测藻株经纯化后进行室内扩大培养；(2)全基因组DNA提取：利用改良的CTAB法分别提取待测藻株及杜氏藻株D.quartolecta的全基因组DNA，冷冻保存；(3)将步骤(2)中的待测藻株及杜氏藻D.quartolecta的全基因组DNA打断、纯化后分别构建DNA测序文库；(4)采用高通量测序法对步骤(3)中的DNA测序文库分别进行测序，获取待测藻株和杜氏藻D.quartolecta全基因组二代测序数据；(5)以NCBI已公布的盐生杜氏藻(D.salina)全基因组数据为参考，将步骤(4)中获取的杜氏藻D.quartolecta全基因组测序数据与其进行比对，通过筛选、从头组装、质量评估后获得杜氏藻D.quartolecta核心基因组序列，该核心基因组序列大小为6592916bp，重叠群数量为3000个，最大重叠群长度为1133322bp，重叠群平均长度为2197.64bp，重叠群N50为15270，完整基因占比23.65％，单拷贝基因占比15.18％，多拷贝基因占比13.76％，空位/缺失占比1.89％，不完整片段占比17.45％，构建从头组装的杜氏藻D.quartolecta核心基因组环状图谱，然后对杜氏藻D.quartolecta核心基因组序列进行基因组分、蛋白功能注释及基因组重叠群共线性分析；(6)以步骤(5)中构建的杜氏藻D.quartolecta核心基因组序列为参考，将步骤(4)获得的待测藻株全基因组测序数据及已公布代表性藻类的基因组测序数据与其进行比对，检测物种间的单核苷酸多态性和插入/缺失位点，然后利用单核苷酸多态性构建系统进化树，当待测藻株与杜氏藻D.quartolecta聚为一簇，且分支的数据支持率在0.99～1.00，遗传相似度百分比大于≥99％，待测藻株即为杜氏藻D.quartolecta。2.根据权利要求1所述的基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(1)中室内扩大培养具体步骤为：对待测藻株藻细胞进行无菌条件下的单克隆挑取，显微镜检合格后在无菌条件下进行室内扩大培养，室内扩大培养条件为：光周期为18h：6h，光照强度为19000lx，温度：23
±
3℃，保持无菌通风环境，每隔5天对培养皿进行摇动以防藻细胞贴壁，并取0.5～1mL藻液进行镜检，培养周期为28
±
7天，配制下述培养基溶液对待测藻株进行室内扩大培养，培养基配方如下：30g/LNaCl，1.5g/LNaNO3，1.4g/LK2HPO4，1.75g/L MgSO4
·
7H2O，1.36g/L CaCl2·
7H2O，1.2g/LNa2CO3，0.006g/LFeC6H5O7，0.005g/LNaH2PO4·
2H2O，0.5g/L Co(NO3)2·
6H2O，0.8g/L CuSO4·
5H2O，2.3g/L ZnSO4·
7H2O，0.03g/L H3BO3，4.0g/L Na2MoO4·
2H2O，0.02g/L MnCl2·
4H2O，0.5g/LVB1，0.5g/LVB
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，VH 0.5g/L，超纯水定容至1L。3.根据权利要求1所述的基于一种杜氏藻核心基因组序列进行品系鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(2)中改良的CTAB法具体步骤为：取600～800mg待测藻株，用超纯水冲洗2～3次，4℃8000r/min离心1.5min，加液氮研磨15sec，加入800μL 20℃预热的2％W/V的CTAB溶液，1μL 1％V/V的β-巯基乙醇，混匀后在60℃水浴1.5h，期间每隔20min摇匀1次，加入800μLTris饱和酚，混匀后4℃12000r/min离心2.5min后取上清，加入体积比为25：24：2的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液，涡旋振荡后4℃静置10min，期间混匀2～3次，加入800μL 0.1％V/V DEPC处理的ddH2O，60℃水浴30min，4℃12000r/min离心4min后取上清液，加入
150mL 3mol/L的乙酸钠及250mL 4～5℃预冷的无水乙醇，-20℃沉淀50min，4℃10000r/min离心3min后弃上清液，加入1mL 4～5℃预冷的70％V/V乙醇溶液并涡旋振荡20sec，弃上清后在核酸真空干燥系统中挥发液体，加入100
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TE缓冲液溶解沉淀以保...

【专利技术属性】
技术研发人员：高帆，宋韡，南芳茹，冯佳，谢树莲，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：