百日咳菌毛蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种百日咳菌毛蛋白的纯化方法，所述方法包括以下步骤：(1)百日咳菌经发酵培养后离心收集沉淀，尿素或其他适宜方法裂解菌体后得到PRN粗纯液，经层析后收集流穿液；(2)采用盐析级联疏水阴离子层析菌毛蛋白(Fim)粗纯液；(3)调节步骤(2)中收集的菌毛蛋白(Fim)粗纯液pH和电导，过CHT层析柱洗脱收集得到Fim抗原。得到Fim抗原。得到Fim抗原。

【技术实现步骤摘要】
百日咳菌毛蛋白的纯化方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体的，涉及一种百日咳菌毛蛋白的纯化方法。

技术介绍

[0002]百日咳(pertussis,whooping cough)是由革兰氏阴性杆菌B.pertussis引起的一种对婴幼儿危害极大的烈性呼吸道传染病。疫苗接种前该疾病在全世界流行，其发病率和死亡率都很高。全细胞百日咳疫苗(whole cell pertussis vaccine,wPV)的接种使该疾病得到了良好的控制，但因接种后引起的较高不良反应，逐渐被更安全的无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine aPV)所取代。2010年以来，在疫苗覆盖率很高的国家，成人和青少年百日咳发病率上升，这些感染的成人和青少年作为传播者，将病原体传播给因年龄太小而无法接种疫苗的易感婴幼儿，因此有学者大胆预言百日咳“重现”已经来临。研究人员进行大量的回顾性研究发现，该疾病重现大致有如下原因：aPV效力的快速下降、疾病预防意识的增强、检测方法的提高和在疫苗选择压力下的菌株变异等。特别在美国、澳大利亚、日本和欧洲等国，都出现了不表达百日咳黏附素(PRN)的临床分离株。我国近几年百日咳病例数也呈现上升趋势，2017年全国共报告病例10390例，2018年22466例，在山东和深圳等地也相继分离出不表达PRN或者具有耐药性的百日咳临床株。接种百日咳疫苗是预防百日咳最经济和最有效的方法，WHO已经推荐成人或者孕期妇女可加强接种一剂百日咳疫苗，来应对百日咳“重现”。目前国内上市的国产aPV都是利用共纯化法(co-purified)纯化出百日咳抗原溶液(主要是PT和FHA)，经脱毒剂处理后吸附铝佐剂而成，进口的aPV是利用技术更先进的柱层析法单独纯化抗原后吸附铝佐剂制成。
[0003]百日咳杆菌在生长过程中产生百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA))、PRN、Fim、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT)、皮肤坏死毒素(dermonecrotictoxin，DNT)等十几种抗原，主流aPV疫苗主要以PT和FHA为主。鉴于百日咳疾病“再现”，迫切需要改进现有百日咳疫苗，WHO也推荐在现有aPV中添加Fim抗原，批准用于人用疫苗，其浓度为5μg/剂量，被认为是当前五组分制品的重要组成部分。Fim称为菌毛，是B.pertussis细菌表面的一种丝状聚合蛋白，有助于细菌对宿主细胞的粘附，主要有Fim2和Fim3两种血清型。有两个强有力的数据支持在疫苗配方中加入Fim2/3抗原，会使缺乏Fim2/3的百日咳杆菌突变体不能在小鼠气管处定植，二是Fim抗体干扰百日咳杆菌对人肺泡上皮细胞系的粘附。在小鼠鼻内挑战模型中，腹腔注射10μg/剂量的Fim蛋白可阻止百日咳杆菌在小鼠肺部定植，在三组分aP疫苗中添加Fim2/3可提高其效力。赛洛菲巴斯德生产的五组分百日咳疫苗含有PT、FHA、PRN和Fim抗原，每剂Fim2/3含量是5μg。人类临床试验中，五组分aPV比二组分或三组分疫苗更有效，这表明Fim2/3的加入提高了aPV疫苗的有效性。
[0004]中国食品药品检定研究所的公开号CN101074442A的专利申请是用基因工程方法从百日咳CS菌株中克隆Fim2和Fim3基因，利用表达载体获得原核表达重组蛋白。
[0005]薛平的公开号CN101507814B的专利申请通过收获菌体沉淀，用去氧胆酸钠磷酸盐
缓液裂解细胞，之后通过盐析、浸提、再盐析、浸提、透析、蔗糖密度梯度离心、戊二醛脱毒、再透析、超声处理得到多组分细胞结构性抗原。此方法生产周期长，生产成本较高。
[0006]康诺特实验室的公开号CN100387618C的专利申请公开了用下述方法纯化菌毛凝集原2和3：
①
百日咳发酵培养液先用磷酸钾、氯化钠和尿素处理；
②
离心得到含菌毛蛋白的上清，在75-85℃温度下保温10-60分钟；
③
将上述保温液继续离心得到含菌毛蛋白的上清，加入聚乙二醇沉淀上清液中菌毛抗原；
④
离心后用10mM磷酸钾/150mM氯化钠缓冲液复溶得到菌毛抗原溶液；
⑤
上述溶液通过Septhadex 6B或PEI硅胶柱进行纯化。此方法是从菌体发酵液中只提取Fim蛋白，而未能同时在提取纯化过程中收获PT、FHA和PRN等抗原，未能有效利用菌体发酵液，增加了生产成本。
[0007]文献报道了专门从菌体中纯化菌毛蛋白的方法：即通过离心、沉淀、离心、盐析、离心、复溶、透析、离心、透析、离心、重悬、离心、重悬、离心、透析等15步完成。
[0008]上述方法步骤较多、耗时长、生产成本高，需要改进和提升大规模连续制备菌毛蛋白的生产工艺。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了一种纯化百日咳菌毛蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)百日咳菌经发酵培养后离心收集沉淀，尿素或其他适宜方法裂解菌体后得到PRN粗纯液，经层析后收集流穿液；
[0011](2)采用盐析级联疏水阴离子层析菌毛蛋白(Fim)粗纯液；
[0012](3)调节步骤(2)中收集的菌毛蛋白(Fim)粗纯液pH和电导，过羟基磷灰石材料层析柱，洗脱收集得到Fim抗原；优选的，所述的羟基磷灰石材料层析柱为CHT层析柱(BIO-RAD)；
[0013]且上述步骤(1)～(3)都在2-8℃条件下进行操作。
[0014]具体的，步骤(2)所述的采用盐析级联疏水阴离子层析菌毛蛋白(Fim)粗纯液的方法为：
[0015]方法一，盐析级联疏水阴离子层析：
[0016]1)在步骤(1)流穿液中加入重量体积比为10-30％的硫酸铵，搅拌1-2小时后，2-8℃静置过夜，离心，弃上清，收集盐析沉淀；
[0017]2)用Tris-HCl缓冲溶液溶解步骤(2)中收集的沉淀，轻轻振荡15-30分钟，充分溶解沉淀，经离心后，弃掉沉淀，收集上清；
[0018]3)调节步骤(3)中收集的上清液pH和电导，过Capto Adhere疏水阴离子层析柱，收集流穿液得到菌毛蛋白(Fim)粗纯液；
[0019]或方法二，疏水阴离子层析级联盐析：
[0020]1)调整步骤(1)流穿液pH和电导，过Capto Adhere疏水阴离子层析柱，收集流穿液；
[0021]2)加入重量体积比为10-30％的硫酸铵，搅拌1-2小时后，2-8℃静置16-24小时，离心，弃上清，收集盐析沉淀；
[0022]3)用Tris-HCl缓冲溶液溶解收集的沉淀，轻轻振荡15-30分钟，充分溶解沉淀，离心收集上清，得到菌毛蛋白(Fim)粗纯液。
[0023]具体的，步骤(2)中：
[0024]所述的硫酸铵盐析的时间是16-24小时；
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化百日咳菌毛蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)百日咳菌经发酵培养后离心收集沉淀，尿素或其他适宜方法裂解菌体后得到PRN粗纯液，经层析后收集流穿液；(2)采用盐析级联疏水阴离子层析菌毛蛋白(Fim)粗纯液；(3)调节步骤(2)中收集的菌毛蛋白(Fim)粗纯液pH和电导，过羟基磷灰石材料层析柱，洗脱收集得到Fim抗原；优选的，所述的羟基磷灰石材料层析柱为CHT层析柱；上述步骤(1)～(3)都在2-8℃条件下进行操作。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的采用盐析级联疏水阴离子层析菌毛蛋白(Fim)粗纯液的方法为：方法一，盐析级联疏水阴离子层析：1)在步骤(1)流穿液中加入重量体积比为10-30％的硫酸铵，搅拌1-2小时后，2-8℃静置盐析，离心，弃上清，收集盐析沉淀；2)用Tris-HCl缓冲溶液溶解步骤(2)中收集的沉淀，轻轻振荡15-30分钟，充分溶解沉淀，经离心后，弃掉沉淀，收集上清；3)调节步骤(3)中收集的上清液pH和电导，过Capto Adhere疏水阴离子层析柱，收集流穿液得到菌毛蛋白(Fim)粗纯液；或方法二，疏水阴离子层析级联盐析...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓明，杨柏峰，田聪，潘聪，胡源，霍梦颖，陈雯，胡太平，施斌，李新国，段凯，朱德武，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：