一种采用离子交换色谱法分离纯化制备胰岛素的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用离子交换色谱法分离纯化制备胰岛素的方法，本发明专利技术采用离子交换色谱技术对胰岛素及其类似物进行分离纯化，该制备方法采用阴阳离子交换色谱填料，通过调节流动相缓冲盐及有机相种类、pH、流速以及流动相洗脱梯度等条件参数，使胰岛素在色谱制备纯化时具有较好的峰形控制和合适的保留行为，通过不同条件下的峰展宽比较最终确定优化纯化条件，实现了胰岛素的高效分离纯化与制备，得到纯度较高胰岛素样品。本发明专利技术与现有色谱纯化方法相比具有载样量大、纯度和收率高、耗时短，对环境影响小、操作简单、稳定性好且溶剂使用量及馏分体积低等优势，可大规模降低现有的胰岛素及胰岛素类似物的产品生产成本，适合于工业化生产。业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种采用离子交换色谱法分离纯化制备胰岛素的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，涉及一种色谱技术纯化分离重组胰岛素或胰岛素类似物的制备方法，具体涉及一种采用离子交换色谱法分离纯化制备胰岛素的方法。
技术背景
[0002]糖尿病为一种慢性代谢性疾病，有多饮、多食、多尿以及体重降低的临床症状，尤其是会引起心脑血管以及神经系统等并发症，患者生命健康受到严重威胁。近年来，全世界糖尿病的发病率正在呈现“爆炸式”增长，患病率达到10％以上。现糖尿病治疗药物种类很多，胰岛素仍是糖尿病治疗效果最佳的首选降糖药物。中国是全球糖尿病第一大国，胰岛素市场前景也将十分广阔，且需求量呈明显上升趋势。
[0003]胰岛素(Insulin)是一种能够降低体内血糖最有效的蛋白激素类药物，是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等刺激而分泌的一种蛋白质激素。1型糖尿病患者和2型糖尿病患者都需注射胰岛素来控制血糖从而提高生活质量以及降低糖尿病并发症的发生。随着胰岛素技术的不断发展，人们通过基因工程手段又相继开发出了诸如赖谷胰岛素、地特胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、德谷胰岛素等新一代胰岛素类似物；但全球每年要消耗胰岛素5000kg左右，产量缺口巨大。胰岛素纯化分离过程中有胰岛素原和性质非常相似的脱酰胺胰岛素等杂质，注射到机体后会引起一定的副作用，所以胰岛素的极高纯度要求显得尤为严格。且目前国内许多生物医药公司都在开展糖尿病药物胰岛素及其类似物的临床申报工作，以致企业之间的竞争态势会日趋激烈，研发低成本大规模制备胰岛素的方法是亟待解决的问题，故胰岛素的高效纯化工艺开发具有重要的意义。
[0004]目前使用大孔树脂与色谱技术结合的工艺方法复杂且回收率降低。因此，需要开发一种纯化效率高、稳定性好的分离纯化工艺来提高胰岛素的纯度和收率，通过更为简便有效的工艺来制备高纯度胰岛素，以利于大规模制备。
[0005]为了达到胰岛素制剂所需要的纯度，大多数联合2-3步离子交换和高效液相制备色谱技术来对胰岛素进行纯化分离。离子交换色谱技术主要去除与胰岛素性质相差较大的杂质，而高效液相色谱作为精制工序可以显著提高胰岛素的纯度，这样整体纯化工序较多，造成总收率会偏低。离子交换色谱在生物大分子纯化过程中非常普遍，可以直接放大规模(应用于工业)，以及使用方便，柱再生容易，另外还使目标蛋白得到浓缩，操作费用也比较低。该技术应用于生物大分子纯化也存在一些不足，比如载样量不够、效率及收率低等问题，且在实际生产中制备方法的开发多凭经验进行，缺乏系统的理论指导。高效的离子交换色谱纯化制备工艺可以减少胰岛素整体纯化工序，显著降低后续反相色谱纯化的压力，提高反相色谱填料的载样量及使用寿命，降低整体生产工艺成本。因此，建立一种高效、成本低、溶剂消耗量小、产品纯度及收率高且适合工业化纯化制备胰岛素及其类似物的色谱纯化方法具有重要的价值和应用前景。
[0006]本专利技术通过对胰岛素的离子交换色谱纯化分离的条件进行方法学优化及峰展宽
摸索获得最佳的纯化制备工艺参数，进一步放大到工业制备级的色谱分离上，得到高纯度的胰岛素。该方法载样量大，操作过程简单，稳定性好，大幅提高了纯化效率及收率。本专利技术的方法学适用于分析色谱、半制备色谱、特别是制备色谱，可以理解为工业规模上制备纯的产品。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种胰岛素及其类似物的纯化制备方法，具体而言，本专利技术提出一种提高胰岛素纯度及收率的离子交换色谱分离制备的新方法，目的在于解决目前在胰岛素粗品纯化制备过程中所存在的收率低、成本较高及纯度不佳的问题。
[0008]本专利技术采用离子交换色谱技术对胰岛素粗样及其类似物进行分离纯化，该制备方法采用阴阳离子交换色谱填料，通过调节流动相缓冲盐溶液及有机相种类、pH、流速以及流动相洗脱梯度等条件参数，使胰岛素在色谱制备纯化时具有较好的峰形控制和合适的保留行为，通过不同条件下的峰展宽比较最终确定的优化纯化条件，实现了胰岛素的高效分离纯化与制备，得到纯度较高胰岛素样品。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的高效纯化制备胰岛素及其类似物的方法如下：
[0010](1)样品前处理：胰岛素样品为胰岛素液体或固体胰岛素粗品粉末；将胰岛素液体与缓冲盐水溶液混合，或将固体胰岛素粗品粉末溶解于缓冲盐水溶液或有机溶剂与缓冲盐水溶液的混合溶液，加酸调节pH至完全溶解，滤膜过滤；
[0011](2)工艺条件的优化：采用非线性色谱方法学进行胰岛素的离子交换色谱纯化条件的优化，具体为：对(1)中处理后的胰岛素样品进行离子交换色谱条件摸索及峰展宽的比较，筛选出色谱柱填料、载样量、流动相包括缓冲盐水溶液种类，pH值，有机相种类及浓度、流动相梯度、流速的工艺参数范围，得出优化的工艺条件；
[0012](3)纯化制备：采用(2)中优化的工艺条件进行胰岛素样品的纯化分离制备；将(1)处理后的胰岛素样品上样至平衡后的离子交换色谱柱，通过调节流动相浓度梯度方式洗脱目标蛋白，收集色谱峰馏分，对馏分进行相关蛋白与高分子蛋白分析检测，合并合格馏分；
[0013](4)馏分后处理：对(3)得到的合格馏分进行后处理，即得到高纯度的胰岛素产品。
[0014]本专利技术的胰岛素样品的胰岛素样品的色谱纯度为20-95％之间。
[0015]本专利技术步骤(1)中胰岛素蛋白的浓度为0.1-50mg/mL；胰岛素的种类可以是人胰岛素、动物胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、地特胰岛素或德谷胰岛素等或者为它们的类似物。
[0016]所述步骤(2)中胰岛素纯化方法学优化的工艺参数中有机相种类为有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈或者异丙醇；所述缓冲盐水溶液为Na
+
、K
+
、Li
+
、H
+
、Et3NH
+
、NH
4+
之一种或两种以上为阳离子，PO
43-、HPO
42-、H2PO
43-、CH3COO-、HCOO-、Cl-、ClO
4-、HCO
3-、SO
32-之一种或两种以上为阴离子的盐；所述缓冲盐水溶液浓度为1-1000mM，缓冲盐水溶液pH值为2.0-10.0；流动相中有机相与缓冲盐水溶液的体积比(V/V)范围为5:95-80:20。
[0017]本专利技术步骤2)中胰岛素色谱纯化的条件包括色谱柱填料的载样量为0.01-40g/L；色谱柱的上样和洗脱流速为20-300cm/h；起始流动相中有机溶剂的含量为0-40％，缓冲盐水溶液离子浓度为0-50mM；梯度洗脱为流动相中缓冲盐水溶液的浓度范围由5-400mM在
0.01-200min内变为500-1000mM，所述洗脱的方式为等度洗脱和梯度洗脱方式，或是两种方式联合的洗脱方案。
[0018]本专利技术步骤2)中离子交换色谱柱的填料基质可以为琼脂糖、葡聚糖或高分子聚合物中的一种；填料本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用离子交换色谱法分离纯化制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：(1)样品前处理：胰岛素样品为胰岛素液体或固体胰岛素粗品粉末；将胰岛素液体与缓冲盐水溶液混合，或将固体胰岛素粗品粉末溶解于缓冲盐水溶液或有机溶剂与缓冲盐水溶液的混合溶液，加酸调节pH至完全溶解，滤膜过滤；(2)工艺条件的优化：采用非线性色谱方法学进行胰岛素的离子交换色谱纯化条件的优化，具体为：对(1)中处理后的胰岛素样品进行离子交换色谱条件摸索及峰展宽的比较，筛选出色谱柱填料、载样量、流动相包括缓冲盐水溶液种类，pH值，有机相种类及浓度、流动相梯度、流速的工艺参数范围，得出优化的工艺条件；(3)纯化制备：采用(2)中优化的工艺条件进行胰岛素样品的纯化分离制备；将(1)处理后的胰岛素样品上样至平衡后的离子交换色谱柱，通过调节流动相浓度梯度方式洗脱目标蛋白，收集色谱峰馏分，对馏分进行相关蛋白与高分子蛋白分析检测，合并合格馏分；(4)馏分后处理：对(3)得到的合格馏分进行后处理，即得到高纯度的胰岛素产品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中胰岛素样品的色谱纯度为20-95％；胰岛素蛋白的浓度为0.1-50mg/mL；胰岛素样品的种类为人胰岛素、动物胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、地特胰岛素或德谷胰岛素或者为它们的类似物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中胰岛素纯化方法学优化的工艺参数中有机相种类为有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈或者异丙醇；所述缓冲盐水溶液为Na
+
、K
+
、Li
+
、H
+
、Et3NH
+
、NH
4+
之一种或两种以上为阳离子，PO
43-、HPO
42-、H2PO
43-、CH3COO-、HCOO-、Cl-、ClO
4-、HCO
3-、SO
32-之一种或两种以上为阴离子的盐的水溶液；所述缓冲盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，叶贤龙，郭志谋，于伟，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：