一种10L规模化提取鸡血抗菌肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种10L规模化提取鸡血抗菌肽的方法。该方法包括破碎：采用机械性破碎和超声波破碎相结合的方法破碎鸡血中的鸡血红细胞，获得鸡血液；酶解：采用木瓜蛋白酶酶解所述鸡血液获得酶解鸡血液，酶解时间为3

【技术实现步骤摘要】
一种10L规模化提取鸡血抗菌肽的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种10L规模化提取鸡血抗菌肽的方法。

技术介绍

[0002]国家农业农村部194号公告中就已明确指出，“自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。”以全面维护动物源食品安全和公共卫生安全。在养猪产业，继高致病猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)，变异的猪伪狂犬病毒(PRV)及2018年发生的非洲猪瘟，病毒性疾病一次次摧毁着我国的养猪业，面对新病毒的进入和老病毒的变异，畜牧行业显得无能为力。抗病毒药物种类本身比较稀少，2005年12月，农业部禁止金刚烷胺、利巴韦林等一系列药物在动物上应用，导致目前基本没有成熟的抗病毒药物应用于畜牧业。在促生长药物添加剂禁用与抗病毒药物的匮乏两大背景下，开发和生产新型环保、安全、有效的抗菌、尤其是抗病毒类药物用于促进畜禽生长及疾病的预防和治疗的环境友好型新型饲料添加剂，已成为摆在畜牧兽医工作者面前的一项迫在眉睫的任务。在开发和寻找新的抗微生物类物质中，抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)无论在人和动物应用方面作为一种新的抗菌物质从上世纪末以来，已成为全球研究的热点，抗菌肽具有抗生素和其他物质无法比拟的优点，尤其是内源性抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性，来自机体自身，起源古老，经几百万年进化仍保留强大的抗微生物活性，故可能是解决上述问题的最佳选择。
[0003]我国每年要屠宰大约100多亿只鸡，产生约50万吨的鸡血，资源充足。鸡血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从鸡血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，既能获得高活性的天然抗菌肽，又能对鸡血进行高价值利用。可谓一举两得。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的为提供一种规模化(10L)提取鸡血抗菌肽的方法，为产业化生产奠定技术支撑。
[0005]本专利技术提供了一种鸡血中抗菌物质的提取方法，该提取方法包括：
[0006]破碎：采用机械性破碎和超声波破碎相结合的方法破碎鸡血中的鸡血红细胞，获得鸡血液；
[0007]酶解：采用木瓜蛋白酶酶解所述鸡血液获得酶解鸡血液，酶解时间为3-9h(如6h)，酶解温度为70℃；
[0008]浸提：将所述酶解鸡血液快速冷却至4℃，加入等体积的5％冰醋酸水溶液静置，静置时间为12-20h(如16h)，离心取上清液，调节pH至6.0
±
0.5(如6.0)，获得鸡血中的抗菌物质，所述快速冷却为30～40min(如30min)之内，所述酶解鸡血液的温度从70℃降至4℃。
[0009]该抗菌物质具体可为鸡血抗菌肽。抗菌性具体体现为抗如下细菌中的至少一种：大肠杆菌(如ATCC 25922)、绿脓杆菌(如ATCC 27853)、嗜水气单胞菌(Genbank ID Sequence ID：gb|KJ156374.1|)。
[0010]可选地，步骤破碎所获得的鸡血液的体积≥5L。
[0011]可选地，所述机械性破碎和超声波破碎相结合的方法为采用机械性破碎将所述鸡血破碎为匀浆，加入蒸馏水，再使用超声波破碎所述鸡血中的鸡血红细胞。其中，蒸馏水的加入量可为所述匀浆的1/5体积。
[0012]可选地，在酶解步骤中，木瓜蛋白酶与所述鸡血液的配比为1-10mg/mL，所述木瓜蛋白酶的酶活为800000U/mg。该配比具体可为5mg/100mL。
[0013]可选地，在浸提步骤中，5％冰醋酸水溶液的体积与所述酶解鸡血液体积相同。
[0014]可选地，在浸提步骤中，所述快速冷却的方法选自下述的一种或多种：
[0015]A1采用恒温循环器冷却所述酶解鸡血液，所述恒温循环器的循环介质为4℃保存的酒精；
[0016]A2在装有所述酶解鸡血液的容器外部放置冰袋；
[0017]A3所述5％冰醋酸水溶液的温度为4℃；
[0018]A4在所述酶解结束前30～40min加入所述5％冰醋酸水溶液。
[0019]在一些实施例中，装有所述酶解鸡血液的容器为玻璃反应器。该玻璃反应器包括内层和外层，内层和外层之间设置有第一容置空间，内层内设置有用于装载样品的第二容置空间。第一容置空间与恒温循环器连通，使恒温循环器的循环介质在第一容置空间和恒温循环器中循环流动，该循环介质用于调节样品温度。玻璃反应器还包括用于精准测定样品温度的温度传感器和用于搅拌样品的搅拌器。
[0020]可选地，在步骤浸提中，所述离心为8000r/min(837g)，4℃离心15-20min。具体可为20min。
[0021]可选地，该提取方法在所述浸提后还包括纯化，所述纯化包括将所述抗菌物质上样于Sephadex G-100凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰，即为纯化后的抗菌物质。所述洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸溶液。在一些实施例中，所述洗脱的速度为12～15mL/cm2/h。具体而言，本专利技术中所采用的Sephadex G-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)。Sephadex G-25凝胶柱(20cm
×
16mm)的柱长度和柱内径比为8∶1。所述上样的上样量为2ml。
[0022]在上述方法中，所述鸡血可为新鲜的鸡血，也可以为经冷冻后融化的鸡血。该鸡血无抗凝剂与抗生素残留。
[0023]利用如上所述方法提取得到的抗菌物质也属于本专利技术的保护范围。
[0024]所述鸡血抗菌物质在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：
[0025]B1制备抗微生物制剂；
[0026]B2制备动物饲料添加剂。
[0027]活性成分为所述鸡血抗菌物质的抗微生物制剂或动物饲料添加剂也属于本专利技术的保护范围。
[0028]以上所有的所述微生物均可为细菌或病毒。在本专利技术中，所述微生物具体为如下细菌中的至少一种：大肠杆菌(如ATCC 25922)、绿脓杆菌(如ATCC 27853)、嗜水气单胞菌(如Genbank ID Sequence ID为gb|KJ156374.1|的嗜水气单胞菌)。
[0029]本专利技术在现有技术基础上进行了鸡血抗菌肽(CBAP)的小规模(10L)分离提取试验，建立一套成熟的提取方法，从实验室的100～200mL小量提取量扩大10L，且不影响抗菌
肽的活性，为鸡血抗菌肽的后续产业化及其在养猪生产中的应用提供了技术支撑。
[0030]试验结果表明鸡血抗菌肽对PRRSV和PRV有直接中和病毒和一定的抗病毒吸附细胞的作用。在养猪场对已发生PRRS的猪群治疗试验也取得了明显的效果，鸡血抗菌肽可加快PRRS发病猪群的康复、减少PRRSV的排放、降低肺脏带毒及减轻肺脏损伤等方面都呈现出了良好的治疗效果。此结果为研发抗病毒新兽药提供了新的思路。同时也研究了鸡血抗菌肽对保育猪的促生长和免疫调节作用，鸡血抗菌肽表现出了显著的促生长和提高保育猪细胞免本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鸡血中抗菌物质的提取方法，其特征在于：所述提取方法包括：破碎：采用机械性破碎和超声波破碎相结合的方法破碎鸡血中的鸡血红细胞，获得鸡血液；酶解：采用木瓜蛋白酶酶解所述鸡血液获得酶解鸡血液，酶解时间为3-9h，酶解温度为70℃；浸提：将所述酶解鸡血液快速冷却至4℃，加入等体积的5％冰醋酸水溶液静置，静置时间为12-20h，离心取上清液，调节pH至6.0
±
0.5，获得鸡血中的抗菌物质，所述快速冷却为30～40min之内，所述酶解鸡血液的温度从70℃降至4℃。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述鸡血液的体积≥5L。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：所述机械性破碎和超声波破碎相结合的方法为采用机械性破碎将所述鸡血破碎为匀浆，加入蒸馏水，再使用超声波破碎所述鸡血中的鸡血红细胞。4.根据权利要求1-3中任一所述的提取方法，其特征在于：所述快速冷却的方法选自下述的一种或多种：A1采用恒温循环器冷却所述酶解鸡血液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：佘锐萍，刘辉，刘天龙，刘波，田纪景，吴桥兴，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：