粉红单端孢菌高产单端孢菌素的方法及其在制备阔叶杂草除草剂中的应用技术

本发明专利技术属于微生物农药技术领域，公开了粉红单端孢菌高产单端孢菌素的方法及其在制备阔叶杂草除草剂中的应用。本发明专利技术开发了一种适用于粉红单端孢菌发酵高产的单端孢菌素的培养基，所述的粉红单端孢菌的保藏编号为CCTCC NO：M2019210。该培养基组分易得，廉价，对于单端孢菌素的产量有极大的提高，比常规培养基提高了200%。本发明专利技术实现了直接将粉红单端孢菌发酵液用于制备阔叶杂草除草剂的工业目的，适用于大规模推广。于大规模推广。

【技术实现步骤摘要】
粉红单端孢菌高产单端孢菌素的方法及其在制备阔叶杂草除草剂中的应用


[0001]本专利技术属于微生物农药
，具体涉及粉红单端孢菌高产单端孢菌素的方法及其在制备阔叶杂草除草剂中的应用。

技术介绍

[0002]随着社会文明的进步和公众健康意识的提高，广泛、长期、大量使用化学除草剂所带来的负面影响日益显现，倍受全球关注。利用自然界生物中具有生物活性的代谢产物开发新的生物源除草剂是除草剂研发的一个重要途径和未来发展方向。因为这类化合物往往具有化学结构新异，作用靶点独特，广谱、低毒、低残留的特点，且受环境影响较小。另外，相对于开发一个新的化学除草剂产品需要耗时10年、花费约2.5亿美元的财力状况，这种利用天然产物研发新除草剂的方式具有定向性、研制周期短、研发费用相对低廉的优点。近年来, 以微生物天然产物开发生物源除草剂或新颖除草剂的先导化合物引起了杂草科学家和农药化学家的极大兴趣，最成功的是双丙氨磷(bialaphos)和草铵膦(phosphinothricin)。
[0003]关于粉红单端孢菌NBERC_49006，是申请人在筛选除草活性天然产物过程发现一株粉红单端孢菌NBERC-49006的乙酸乙酯提取物显示良好的抑制种子萌发作用，并且分离得到一个活性化合物单端孢菌素(Trichothecin)(吴兆圆等，天然产物研究与开发，2019(31)， 1772-1776)，在该文章中公开了单端孢菌素(Trichothecin)对拟南芥种子的抑制能力为 LC
50
9.30ug/ml，但用单端孢菌素为32ug/ml的测试浓度测试狗牙根的萌发情况时，发现其不能抑制，说明其对狗牙根种子的起效浓度大于32ug/ml，或者其对狗牙根种子不起作用。而对拟南芥能其作用的除草剂，在实际生产中，并没有太大的借鉴作用，拟南芥是一种模式植物，在除草剂的筛选中具有高敏感性的特点，但是对杂草的除草实验缺乏一致性，很有可能导致假阳性的结果(张志刚等，湖北农业科学，2014(53)：5371-5373)因此，在考虑到生物除草的生产成本以及除草效果的情况下，依然亟待开发一种可发酵后直接可用于除草的生物菌剂。
[0004]发酵培养基的配方是发酵工业中非常关键的因素，其直接影响代谢产物的产量以及后续的生产成本。尽管现有的发酵培养基很多，也有很多成功的范例，但是由于微生物菌种的多样性，不同菌种之间配方没有参考和借鉴意义。例如，对于多杀菌素的产生菌，采用的优化配方为葡萄糖50g/L，麦芽糖10g/L，棉籽粉20g/L，硫酸铵1g/L，硫酸锌0.2g/L，玉米浆15g/L,牛肉膏2g/L，碳酸钙5g/L，产量提高31.6％(朱明军等，农药，2009(48)：728-731)；而对阿维菌素的发酵，较好的配方为淀粉12％，豆饼粉2.5％，酵母粉1％，氯化钴0.004％，碳酸钙0.08％，还原糖初始浓度1-2％(陈万河，浙江工业大学，2008)，两者的培养基配方完全不一样。
[0005]在发酵培养基的筛选中，影响比较显著的成分有碳源、氮源、无机盐以及一些微量元素。目前可以用于工业生产的碳源、氮源、无机盐等种类非常多，特别是碳源和氮源来源
通常为天然的组分，这些组分对于产物产量的影响很大，也导致在筛选配方时随机性和工作量巨大。如宋渊等人在前期工作的基础之上，进一步筛选170余种培养基配方，才得到一个理想的培养基配方(宋渊等，中国抗生素杂志，2001(26)：176-180)。另外，由于活性代谢产物为次生代谢产物，对微生物本身为非必须化合物，一般使其大量代谢产生均存在一定困难，如多杀菌素、洛伐他汀等发酵培养基优化，其产量增加17-56％之间(吴波等.中国抗生素杂志， 2007(07):409-413；胡旭晔等，中国医药工业杂志,2007,38(2):90-93；朱明军等，农药， 2009,48(10):728-731.)。

技术实现思路

[0006]本专利技术在于提供了一种适用于粉红单端孢菌发酵高产单端孢菌素的培养基，所述的粉红单端孢菌的保藏编号为CCTCC NO：M2019210。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供了一种粉红单端孢菌发酵高产单端孢菌素的方法，所述的粉红单端孢菌的保藏编号为CCTCC NO：M2019210。
[0008]本专利技术的最后一个目的在于提供了一种粉红单端孢菌NBERC_49006发酵高产单端孢菌素的培养基或其方法在制备生物除草剂中的应用。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0010]一种适用于粉红单端孢菌NBERC-49006发酵高产单端孢菌素的培养基，包括：淀粉 10-20g/L，葡萄糖2-5g/L，豆粕2-5g/L，酵母膏0.5-1g/L，磷酸二氢钾1-1.25g/L，硫酸镁 0.5-0.625g/L，其余为水，自然pH，所述的粉红单端孢菌的保藏编号为CCTCC NO： M2019210。
[0011]一种粉红单端孢菌发酵高产单端孢菌素的方法，包括将保藏编号为CCTCC NO： M2019210的粉红单端孢菌接种于上述培养基中进行发酵培养。
[0012]本专利技术的保护范围还包括上述培养基，或者培养方法在制备阔叶杂草除草剂中的应用；所述的杂草包括：小飞蓬、反枝苋、牛膝、空心莲子草、鸭趾草、苦荬菜、鬼针草、苍耳、田旋花、墨旱莲。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0014]1.本专利技术解决了目前无法直接用粉红单端孢菌NBERC_49006发酵液制备除草剂的问题；根据现有的发酵配方，通过现有的成分之间的比例调配，单端孢菌素在发酵液的最高浓度只能达到99μg/mL，远远低于化合物在实际使用中的有效浓度，完全无法满足实际生产应用需求。而利用本专利技术的培养基，发酵培养后，发酵液中的目的产物浓度可接近300μg/mL，提高了200％，这是在发酵领域极难达到的提升高度。
[0015]2.利用本专利技术的方法获得的发酵液，可直接用于阔叶杂草(小飞蓬、反枝苋、牛膝、空心莲子草、鸭趾草、苦荬菜、鬼针草、苍耳、田旋花、墨旱莲)苗期草的去除，具备极大的应用前景。
附图说明
[0016]图1为粉红单端孢菌活性提取物、Trichothecin和商业除草剂草甘膦处理14天后对空心莲子草仿效对比；
[0017]其中：CK为0.1％吐温-80的无菌水，活性提取物原始浓度中含有Trichothecin250
1.25g/L，硫酸镁0.625g/L，其余为水，自然pH值，500mL三角瓶装液量100mL。
[0035]发酵培养基E：淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，鱼粉5g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾1.25 g/L，硫酸镁0.625g/L，其余为水，自然pH值，500mL三角瓶装液量100mL。
[0036]发酵培养基F：淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，豆粕5g/L，蛋白胨1g/L，磷酸二氢钾1.25 g/L，硫酸镁0.625g/L，其余为水，自然pH值，500mL三角瓶装液量100mL。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于粉红单端孢菌发酵高产单端孢菌素的培养基，包括：淀粉10-20 g/L，葡萄糖2-5 g/L，豆粕2-5 g/L，酵母膏0.5-1 g/L，磷酸二氢钾1-1.25 g/L，硫酸镁0.5-0.625 g/L，其余为水，自然pH。2.一种粉红单端孢菌发酵高产单端孢菌素的方法，包括将保藏...

【专利技术属性】
技术研发人员：方伟，吴兆圆，刘芳，张志刚，张亚妮，万中义，王开梅，
申请(专利权)人：湖北省生物农药工程研究中心，
类型：发明
国别省市：