一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法技术

本发明专利技术公开一种以廉价烯烃化合物和氰酸盐为原料，通过双酶一锅一步催化合成高附加值手性噁唑烷酮类化合物的方法，属于生物催化方法及应用技术领域。所述的双酶为苯乙烯单加氧酶和卤醇脱卤酶两种生物催化剂，可通过重组基因工程菌发酵制备。该工艺技术可实现原料和两种催化剂同时投入反应体系，反应条件温和，工艺操作简单。同时，该工艺无需对中间物进行分离纯化，简化了生产过程，提高了产物的收率。提高了产物的收率。提高了产物的收率。

【技术实现步骤摘要】
一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法


[0001]本专利技术属于生物催化方法及应用
，特别涉及一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法。

技术介绍

[0002]手性噁唑烷酮类化合物是一类重要手性砌块，广泛用于医药化工产品的合成，如公布号为CN111164071A，CN108976222A，CN109384700A，CN110372624A，CN110128473A，CN111471041A，CN110878079A，CN109810038A等等的专利。特别地，手性噁唑烷酮类化合物是一类新型的治疗细菌性感染的抗菌药物，可抑制蛋白质合成的起始阶段，并且很少出现交叉耐药性。2000年4月，第一个噁唑烷酮类抗生素利奈唑胺(Linezolid)在美国批准上市，用于治疗多重耐药革兰氏阳性菌引起的感染。利奈唑胺随后被证实是治疗革兰氏阳性菌引起的严重感染的一个重要抗生素药物。2014年6月，美国FDA批准另一种手性噁唑烷酮类抗生素特地唑胺(Tedizolid)上市，用于治疗皮肤感染。此外，重磅抗凝血药物利伐沙班(Rivaroxaban)也含有的重要手性噁唑烷酮骨架。此外，仍有许多药物通过手性噁唑烷酮进行合成(CN110291093A，CN107459501B，CN107353305A，CN107033095B，CN109311865A)，因而开发相应的手性噁唑烷酮中间体合成技术在医药工业领域具有重要的应用意义。
[0003]传统制备手性噁唑烷酮的合成技术通常以手性的1,2-氨基醇、氮杂环丙烷和环氧化物为起始原料，原料成本高，合成工艺复杂，反应条件苛刻。2005年Dick B.Janssen报道了利用来源于Agrobacterium radiobacter AD1的卤醇脱卤酶HheC催化环氧化合物与氰酸盐反应合成5-取代噁唑烷酮化合物(Organic letters 10.12(2008):2417-2420)。该方法利用消旋的环氧化合物为起始原料，通过动力学拆分获得手性5-取代噁唑烷酮类化合物，但该合成工艺的最大理论收率为50％。此外，反应结束后，未被拆分的手性环氧底物和手性噁唑烷酮产物同时存在于反应体系中，增加了后续分离纯化成本。前期，我们公开一种利用来源于Ilumatobacter coccineus菌株的卤醇脱卤酶重组菌，提供了一种生物催化环氧化合物合成4-取代噁唑烷酮类化合物的方法(CN109593069A)。该工艺虽然为4-取代噁唑烷酮类化合物的合成提供了有效策略，但由于使用的卤醇脱卤酶的立体选择性不佳，无法获得手性的4-取代噁唑烷酮类化合物。

技术实现思路

[0004]本专利技术意在克服上述酶催化工艺的缺陷，通过生物级联工艺设计，提供一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法。
[0005]本方案中的一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，以烯烃和氰酸盐为原料，利用苯乙烯单加氧酶和卤醇脱卤酶两种生物催化剂，通过一锅一步转化合成手性噁唑烷酮类化合物。
[0006]本专利技术通过生物级联工艺设计，以烯烃和氰酸盐为起始原料，构建了双酶一锅一步催化合成手性噁唑烷酮类化合物。该工艺出发原料廉价，反应条件温和，反应操作简便，
反应理论产率可达100％，实际收率为37％-70％，更重要的是获得手性噁唑烷酮产物的光学纯度高达99％。
[0007]进一步，所述烯烃和氰酸盐以及两种所述生物催化剂是一次性投入反应器，进行一锅一步催化合成。两种酶催化的反应之间无不利影响。
[0008]进一步，所述的烯烃为苯乙烯类化合物。
[0009]进一步，所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。
[0010]进一步，所述苯乙烯单加氧酶和卤醇脱卤酶是以大肠杆菌为宿主重组表达而得。
[0011]优选的，本专利技术的一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，通过以下式(1)获得手性噁唑烷酮类化合物：
[0012][0013]进一步，所述的苯乙烯单加氧酶来自Pseudomonas sp.VLB120菌株，两条多肽链的氨基酸序列在NCBI数据库的登录号分别为AAC23718.1和AAC23719.1。
[0014]优选的，通过共表达质粒pETDuet-1在大肠杆菌中重组表达所述苯乙烯单加氧酶。
[0015]进一步，通过重组苯乙烯单加氧酶工程菌发酵获得发酵细胞，并以此作为苯乙烯单加氧酶生物催化剂进行转化反应。
[0016]进一步，所使用卤醇脱卤酶来自Ilumatobacter coccineus菌株，氨基酸序列在NCBI登陆号为BAN03849.1。
[0017]优选的，通过共表达质粒pCDFDuet-1在大肠杆菌中重组表达卤醇脱卤酶；
[0018]进一步，通过重组卤醇脱卤酶工程菌发酵获得发酵细胞，并以此作为卤醇脱卤酶生物催化剂进行转化反应。
[0019]进一步，所述一锅一步催化合成的反应条件为：氰酸盐与烯烃的摩尔比为8:1～1:1之间；反应时间为6～24小时；重组苯乙烯单加氧酶大肠杆菌的细胞浓度为5～20g DCW/L；重组卤醇脱卤酶大肠杆菌的细胞浓度为5～20g DCW/L；pH为6.0～9.0的缓冲溶液；反应温度为25～45℃；烯烃的浓度为0～50mmol/L。DCW表示干细胞重量。
[0020]进一步，所述一锅一步催化合成的反应条件为：氰酸盐与烯烃的摩尔比为4:1；反应时间为8-12小时；重组苯乙烯单加氧酶大肠杆菌的细胞浓度为5g DCW/L；重组卤醇脱卤酶大肠杆菌的细胞浓度为10g DCW/L；pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液；反应温度为30℃；烯烃的浓度为10mmol/L。
附图说明
[0021]图1为苯乙烯单加氧酶StyA基因的克隆示意图；
[0022]图2为苯乙烯单加氧酶StyB基因的克隆示意图；
[0023]图3为(R)-4-苯基-2-噁唑烷酮不对称合成反应时间比较。
具体实施方式
[0024]本专利技术用下列实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术的保护范围并不限于下列实施例。
[0025]前期准备：苯乙烯单加氧酶工程菌的构建
[0026]为了表述方便，将苯乙烯单加氧酶的两条多肽链AAC23718.1和AAC23719.1的编码基因分别命名为StyA和StyB。
[0027]通过DNA分离试剂盒分离提取含有目标基因的pET28b-StyA质粒，选择具有两个克隆位点的pETDuet-1作为表达载体并通过NcoⅠ和HindⅢ双酶切连接，将StyA目的基因插入pETDuet-1载体的第一个克隆位点MCS I，实验实施示意图如附图1所示。
[0028]双酶切反应体系如下：
[0029][0030]酶切反应2小时后通过DNA回收试剂盒分别回收StyA和载体的DNA片段，回收的片段通过T4 DNA连接酶进行连接反应，连接反应体系如下：
[0031][0032]连接反应在16℃的金属浴反应过夜后，产物采用热激法转化导入感受态细胞大肠杆菌DH5α中。在转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，其特征在于：以烯烃和氰酸盐为原料，利用苯乙烯单加氧酶和卤醇脱卤酶两种生物催化剂，通过一锅一步转化合成手性噁唑烷酮类化合物。2.根据权利要求1所述的一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，其特征在于：所述烯烃和氰酸盐以及两种所述生物催化剂是一次性投入反应器，进行一锅一步催化合成。3.根据权利要求2所述的一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，其特征在于：所述的烯烃为苯乙烯类化合物。4.根据权利要求3所述的一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，其特征在于：所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。5.根据权利要求4所述的一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，其特征在于：所述苯乙烯单加氧酶和卤醇脱卤酶是以大肠杆菌为宿主重组表达而得。6.根据权利要求4或5所述的一种双酶级联催化合成手性噁唑烷酮类化合物的方法，其特征在于：所述的苯乙烯单加氧酶的两条多肽链的氨基酸序列在NCBI数据库的登录号分别为AAC23718.1和AAC23719.1；所述的卤醇脱卤酶的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：万南微，陈永正，周孝英，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：