用于抗微生物剂敏感性测试的样品制备制造技术

本公开内容提供了用于来自患者的微生物样品制备的新型方法，所述方法得到了用于抗微生物剂敏感性测试（AST）的高质量输入材料，而无需平板培养。本公开内容的某些方法包括多重分离步骤，以纯化用于AST中的微生物样品。以纯化用于AST中的微生物样品。以纯化用于AST中的微生物样品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于抗微生物剂敏感性测试的样品制备
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求于2018年3月2日提交，且名称为“Sample Preparation for Antimicrobial Susceptibility Testing”的美国临时申请62/637,786的优先权。前述申请整体且为了所有目的引入本文作为参考。
[0002]公开内容领域本公开内容涉及临床微生物样品的制备和测试。
[0003]背景抗微生物剂抗性的微生物感染与不良临床结果（包括受感染患者中的发病率、死亡率和健康护理成本增加）相关。在过去的30年中，这些生物在美国的流行率稳步增加。微生物的表型抗微生物剂敏感性测试（AST）对于告知医师适当的治疗方案至关重要。使用目前方法，AST测定一般需要最少8小时，由于许多临床微生物学实验室中的轮班工作而使其成为过夜过程。在等待来自目前AST方法的测定的同时，患者经常被施用广谱抗微生物剂，其经常对患者健康具有显著的不利作用和/或促成正在增加的抗微生物剂抗性流行。此外，获得准确的抗微生物治疗信息的这种时间延迟增加患者在医院中的停留，从而增加患者的成本和不便。
[0004]在这种背景下，政府和行业利益相关者已提议了促进医院中的抗微生物剂管理的规定。然而，由于目前AST方法和抗微生物剂处方实践的局限性，抗微生物剂管理努力可能变得很复杂。本专利技术人先前已公开了用于快速AST的方法，其可以减少AST测定所需的时间并促进抗微生物剂管理。例如，共同拥有的美国专利号9,834,808和PCT公开WO 2018/119439中描述了利用结合微生物表面的荧光探针的AST系统和方法。这些系统和方法的优点在于，它们以经济有效的方式满足了这个需求，并且可以与现有的测定硬件组件兼容。
[0005]传统的AST方法利用基于平板的培养物样品制备，以纯化微生物并且从原始样品中去除污染物，该过程通常需要过夜培养。减少或消除关于过夜、基于平板的培养的需求可以潜在地加速将AST结果递交给开处方者，其依次又可以改善患者结果。因而，当今该领域中需要快速的样品制备方法，其将微生物病原体维持在合适的状态下用于执行AST，同时去除细胞如血细胞和可溶性种类如抗生素。
[0006]概述本公开内容提供了用于直接从患者样品和/或培养的血液样品中获得合适的AST输入材料的系统和方法，所述样品通过确定的方法（例如连续的血液培养监测）测定为对于微生物生长呈阳性。因此，下文所述的系统和方法允许用于AST的患者样品的快速处理，并且减少了关于快速AST测定结果的时间。在本公开内容的各个方面，患者样品是人样品或经处理的人样品，例如尿、血液、滑液、脑脊髓液、痰、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子或伤口拭子。本公开内容的处理方法可以利用酶来降解样品基质，例如用于痰，或利用流体来分散样品，例如用于拭子。如本领域技术人员已知的，血液样品也可以通过液体培养或“血瓶”进行处理。此类样品可以是“阳性”血液培养物，或者可以来自在33-37℃下优选温育4-10小时，但尚未确定为阳性的瓶。
[0007]根据本公开内容的这些方面，提供了从血液培养物中分离微生物的方法。在本公开内容的某些实施方案中使用的血液培养物可以以任何合适的方式，例如由血液培养物进行制备，所述血液培养物已使用连续监测血液培养系统确定为阳性的，所述系统例如BACTEC
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（Becton-Dickinson）、BacT/Alert
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（bioM
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rieux）和VersaTrek
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（Thermo Fisher）。通过在初始离心后利用裂解剂，本公开内容的示例性方法能够适当地去除影响光学测量的多种溶血凝块、真核细胞和真核细胞片段，同时易于自动化。具体地，本文描述的方法克服了对于基于凝胶的滤器，例如由Lupetti等人描述的血清分离管，或固体滤器，例如在Machen等人PLoS ONE 9（2）：e87870中描述的膜滤器(其表征了目前的领域标准方法)的需要。
[0008]在一些方面，本公开内容描述了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：（a）以<1000 RCF离心；（b）收集来自步骤a的第一上清液；（c）用一种或多种裂解剂处理第一上清液；（d）以>1000 RCF离心来自步骤c的经处理的第一上清液；（e）去除来自步骤d的上清液；（f）将微生物团块重悬浮于盐水或合适的缓冲溶液中；（g）任选地在步骤f的团块重悬浮之后，任选地通过重复步骤d-e，将团块洗涤一次或多次；并且（h）定量细胞悬浮液。
[0009]进一步地，裂解剂可以包括但不限于皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。除一种或多种裂解剂之外，裂解剂还可以包含一种或多种水溶性化合物。水溶性化合物可以包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。裂解剂可以包含皂苷、SPS和PPG。裂解剂可以包含氯化铵，并且在裂解期间添加碳酸氢钾。裂解剂可以包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。裂解剂可以包含Brij 97和CAPS。
[0010]进一步地，可以不洗涤团块。团块可以洗涤一次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以在洗涤溶液添加之后进行重悬浮。团块可以在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。团块可以洗涤两次。洗涤可以用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。团块可以在洗涤溶液添加之后进行重悬浮。团块可以在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。可以在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学定量重悬浮的团块中的细胞。细胞可以通过分光计、分光光度计或浊度计进行定量。细胞可以在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行定量。前体化合物可以包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。可以将前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。第一离心可以是500 RCF。第二离心可以是2370 RCF。第三离心可以是2370 RCF。第四离心可以是2370 RCF。一次或多次离心可以以<90
°
的固定角度执行。一次或多次离心可以以相对于旋转轴30
°
、45
°
、60
°
的固定角度执行。
[0011]在一些方面，可以对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行该方法。可以对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行该方法。可以对尿样品执行该方法。衍生自患者的样品体积小于20 mL、15 mL、10 mL。
[0012]在一个实施方案中，本公开内容讨论了用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：a. 以<1000 RCF离心；b. 收集来自步骤a的第一上清液；c. 用一种或多种裂解剂处理第一上清液；d. 以>1000 RCF离心来自步骤c的经处理的第一上清液；e. 去除来自步骤d的上清液；f. 将微生物团块重悬浮于盐水或合适的缓冲溶液中；g. 任选地在步骤f的团块重悬浮之后，任选地通过重复步骤d-e，将所述团块洗涤一次或多次；和h. 任选地通过测量在500至700 nm之间的一个或多个波长处的光密度，来定量所述细胞悬浮液。2.权利要求1的方法，其中所述裂解剂包括但不限于皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述裂解剂包含一种或多种水溶性化合物。4.权利要求3的方法，其中所述水溶性化合物包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述裂解剂包含皂苷、SPS和PPG。6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵，并且在裂解期间添加碳酸氢钾。7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述裂解剂包含Brij 97和CAPS。9.权利要求1-6中任一项的方法，其中不洗涤所述团块。10.权利要求1-7中任一项的方法，其中将所述团块洗涤一次。11.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。12.前述权利要求的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后进行重悬浮。13.权利要求10的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。14.权利要求1-9中任一项的方法，其中将所述团块洗涤两次。15.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。16.前述权利要求的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。17.权利要求14的方法，其中所述团块在洗涤溶液添加之后不进行重悬浮。18.权利要求1-17中任一项的方法，其中将所述团块重悬浮于盐水、中性缓冲液或生长培养基中。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学定量所述重悬浮的团块中的细胞。20.前述权利要求的方法，其中所述细胞通过分光计、分光光度计或浊度计进行定量。21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述细胞在用一种或多种前体化合物处理悬
浮细胞之后进行定量。22.前述权利要求的方法，其中所述前体化合物包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。23.权利要求16-22中任一项的方法，其中将所述前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述第一离心是500 RCF。25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述第二离心是2370 RCF。26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述第三离心是2370 RCF。27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述第四离心是2370 RCF。28.权利要求1-27中任一项的方法，其中一次或多次离心以<90
°
的固定角度执行。29.权利要求1-28中任一项的方法，其中一次或多次离心以相对于旋转轴30
°
、45
°
、60
°
的固定角度执行。30.权利要求1-29中任一项的方法，其中对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行所述方法。31.前述权利要求的方法，其中对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行所述方法。32.权利要求1-31中任一项的方法，其中对尿样品执行所述方法。33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述衍生自患者的样品体积小于20 mL、15 mL、10 mL。34.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：a. 对样品施加< 1000
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g的相对离心力（RCF），从而产生微粒耗竭的上清液；b. 在微粒耗竭的上清液中裂解至少一种患者细胞或血小板，从而产生患者细胞耗竭的上清液；c. 对患者细胞耗竭的上清液施加>1000
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g的RCF，从而形成团块；d. 收集并重悬浮所述团块；e. 任选地通过重复步骤c和d，将所述团块洗涤一次或多次；和f. 评价盐水或缓冲溶液中的微生物密度。35.权利要求34的方法，其中通过裂解剂完成所述裂解，所述裂解剂包括但不限于皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。36.权利要求35的方法，其中除所述一种或多种裂解剂之外，所述裂解剂还包含一种或多种水溶性化合物。37.权利要求36的方法，其中所述水溶性化合物包括但不限于多聚茴香脑硫酸钠（SPS）、聚丙二醇（PPG）、碳酸钾、碳酸氢钾、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸（CAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠。38.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含皂苷、SPS和PPG。39.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾。40.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含氯化铵和碳酸氢钾以及EDTA或EDTA钠盐。
41.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述裂解剂包含Brij 97和CAPS。42.权利要求34-41中任一项的方法，其中不洗涤所述团块。43.权利要求34-42中任一项的方法，其中将所述团块洗涤一次。44.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。45.权利要求34-44中任一项的方法，其中将所述团块洗涤两次。46.前述权利要求的方法，其中所述洗涤用盐水、中性缓冲液或生长培养基执行。47.权利要求34-46中任一项的方法，其中将所述团块重悬浮于盐水、中性缓冲液或生长培养基中。48.权利要求34-47中任一项的方法，其中在500 nm至700 nm之间的一个或多个波长处，光学评价所述重悬浮的团块中的细胞。49.前述权利要求的方法，其中所述细胞通过分光计、分光光度计或浊度计进行评价。50.权利要求34-48中任一项的方法，其中所述细胞在用一种或多种前体化合物处理悬浮细胞之后进行评价。51.前述权利要求的方法，其中所述前体化合物包括但不限于PicoGreen、吖啶橙、RedSafe、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚、溴化乙锭、SYBR绿I、SYBR绿II、萤光素和刃天青。52.权利要求50-51中任一项的方法，其中将所述前体化合物加入重悬浮的团块悬浮液的等分试样中，然后测量该等分试样。53.权利要求34-52中任一项的方法，其中所施加的第一RCF是500 RCF。54.权利要求34-53中任一项的方法，其中所施加的第二RCF是2370 RCF。55.权利要求34-54中任一项的方法，其中所施加的第三RCF是2370 RCF。56.权利要求34-55中任一项的方法，其中所施加的第四RCF是2370 RCF。57.权利要求34-56中任一项的方法，其中一个或多个RCF以<90
°
的固定角度施加。58.权利要求34-57中任一项的方法，其中对来自连续监测系统的阳性血液培养物执行所述方法。59.前述权利要求的方法，其中对引入连续监测血液培养系统内之后≤48小时转阳的培养物执行所述方法。60.权利要求34-59中任一项的方法，其中所述衍生自患者的样品体积小于20 mL、15mL、10 mL。61.一种用于制备用于抗微生物剂敏感性测试的样品的自动化方法，所述样品怀疑包含衍生自患者的病原微生物，所述方法包括以下步骤：a. 对样品施加第一相对离心力，从而产生相对澄清的上清液；b. 在相对澄清的上清液中裂解至少一种患者细胞或血小板，从而产生患者细胞耗竭的上清液；c. 对来自步骤b的样品施加第二相对离心力，从而形成团块；d. 去除上清液；e. 任选地通过重复步骤c和d，将所述团块洗涤一次或多次；f. 将所述团块重悬浮于合适的盐水或缓冲溶液中；和g. 评价盐水或缓冲溶液中的微生物密度。62.权利要求61的方法，其中所述裂解至少一种患者细胞的步骤包括使所述澄清的上
清液与选自以下的裂解剂接触：皂苷、tritons、tweens、氯化铵、脱水山梨糖醇酯、非离子型聚氧乙烯表面活性剂。63.权利要求62的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：赛录科试诊断公司，
类型：发明
国别省市：