用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒，其中探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:7所示，或者在SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7的序列两端加以基团修饰。本发明专利技术的用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒，在检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性时，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点。高通量检测等优点。高通量检测等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说涉及用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针、引物、试剂盒。

技术介绍

[0002]华法林是目前临床上使用最早、最多、最广的口服抗凝药，已被应用于多种疾病的抗凝治疗，如静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等，但其临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，尤其在使用华法林抗凝治疗初期，极易导致严重的出血并发症。据估计，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命的大出血占3.5％，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。
[0003]CYP2C9是细胞色素P450酶(CYP)第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％。CYP2C9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均为治疗指数较窄的药物。CYP2C9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。CYP2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)均导致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。CYP2C9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异现象。
[0004]维生素k氧化还原酶是抗凝药物华法林的作用靶点。维生素K环氧化物还原酶复合物1的编码基因VKORC1的遗传变异可通过影响VKORC1表达，从而影响华法林的敏感性。位于该基因启动子区(-1639G>A)的单核苷酸突变rs9923231可影响VKORC1的表达，是导致华法林用药剂量个体差异的主要原因之一。与该位点AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均华法林剂量分别增加52％(95％CI：41～64％)和102％(95％CI：85～118％)。VKORC1多态性对华法林剂量影响的比重因种族而异，-1639GA和GG基因型对白种人华法林剂量的影响比对亚洲人的影响分别高10％和50％。总体上，VKORC1多态性在不同种族不同人群中可解释约27％华法林用药剂量的个体差异。VKORC1-1639A等位基因在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为91.17％、38.79％和10.81％(根据千人数据库的结果：在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为92％、40％和7％)，其频率分布的种族差异与华法林用药剂量差异间具有很好的相关性。VKORC1多态性同时也影响华法林用药的临床后果。
[0005]大量研究表明，在我国华法林代谢酶基因CYP2C9*2和CYP2C9*3位点多态性和华法林靶点基因VKORC1-1639G>A位点多态性与其抗凝疗效密切相关，不同基因型患者所需华法林剂量差异明显。美国FDA于2010年对华法林的说明书进行更新，建议结合VKORC1和CYP2C9基因型考虑华法林的初始用药剂量，从而达到辅助优化华法林的使用目的，并降低出血危
险。
[0006]目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此，需要开发一种适合大批量样本检测的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的首先在于提供3组用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:7所示；或者在SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7的序列两端加以基团修饰；
[0008]其中修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团，如FAM、HEX、CY5；3
′
的修饰基团为淬灭基团，如BHQ1、BHQ2；
[0009]具体的说，本专利技术提供的用于检测CYP2C9*2(rs1799853，C430T)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:1HEX-CGAGCATTGAGGACNGTGTTCAAGAGGCTCG-BHQ1；
[0010]其中N为变异碱基，具体为C>T；
[0011]所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～26bp(5
′-
ATTGAGGACNGTGTTCAAGAG-3
′
)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5
′-
CGAGC
……
GCTCG-3)。
[0012]本专利技术提供的用于检测CYP2C9*3(rs1057910，A1075C)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:4FAM-CCAGAGATACNTTGACCTTCTGG-BHQ1；
[0013]其中N为变异碱基，具体为A>C；
[0014]所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～18bp(5
′-
GATACNTTGACCT-3
′
)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5
′-
CCAGA
……
TCTGG-3)。
[0015]本专利技术提供的用于检测VKORC1(-1639G>A)(rs9923231)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:7CY5-CCACCGCACCNGGCCAATGGTGG-BHQ2；
[0016]其中N为变异碱基，具体为G>A；
[0017]所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～18bp(5
′-
GCACCNGGCCAAT-3
′
)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5
′-
CCACC
……
GGTGG-3)。
[0018]探针的设计原理为：根据CYP2C9基因多态性rs1799853和rs1057910，VKORC1基因多态性rs9923231分别设计探针和引物，需要保证在退火温度下DNA模板不存在时，探针呈茎环状态。探针所采用的淬灭基团为BHQ1或BHQ2，其淬灭空间范围很小，搭配短发射波长的荧光基团，如HEX，只有当分子信标呈茎环结构时，荧光才会被很好地淬灭。环序列与靶DNA序列互补时，确定最佳PCR引物为40-45bp大小，PCR产物长度100-150bp。
[0019]本专利技术还提供了3组用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的的引物，该引物的序列如SEQ ID NO.:2、5、8(引物1)和SEQ ID NO.:3、6、9(引物2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测CYP2C9基因和VKORC1基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:7所示；或者在SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7的序列两端加以基团修饰。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于其中SEQ ID NO.:1的修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团HEX；3
′
的修饰基团为淬灭基团BHQ1；其中SEQ ID NO.:4的修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团FAM；3
′
的修饰基团为淬灭基团BHQ1；其中SEQ ID NO.:7的修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团CY5；3
′
的修饰基团为淬灭基团BHQ2。3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述的探针包括环序列和茎序列，其中SEQ ID NO.:1的环序列为第6～26bp；其中SEQ ID NO.:4...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛丹丹，张小燕，张奕，傅咏南，
申请(专利权)人：上海利康精准医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：