富兮双染染色试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种用于所有病理组织切片(特别是肺癌TNM分期)的染色试剂盒及其使用方法。本发明专利技术提供的染色试剂盒及其使用方法将免疫组化染色与特殊染色联合应用，可以在同一张切片上完成两种染色方式，缩短了染色时间，且展示出的信息量远比传统分别单染提供的信号与信息量大，避免了微小浸润的漏诊，可以为临床后期治疗提供行之有效的帮助，为明确病人的临床分期提供了重要的诊断依据，还能够准确判断出其他类型肿瘤是否存在脉管瘤栓。若选择其他类型的标志物，也可以作为心血管疾病判别的一种指标。种指标。

【技术实现步骤摘要】
富兮双染染色试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于生物检测
的病理染色方法。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，严重威胁着患者健康。肿瘤准确分期是精准治疗的前提条件，比如肺癌胸膜受侵与否是肿瘤分期及术后辅助化疗的关键指标之一。
[0003]关于肺癌胸膜受侵与预后及治疗的关系，早在1958年即有学者观察到肺癌胸膜受侵是不良预后因素，1975年脏层胸膜侵犯作为了TNM分期(T：原发肿瘤；N：区域淋巴结；M：远处转移)中的一个独立概念。1988年，Hammar首先提出肺癌胸膜侵犯的分级方法：P0-没有胸膜侵犯，肿瘤未超出脏层胸膜弹力层；P1-肿瘤侵犯超过弹力层；P2-肿瘤侵犯脏层胸膜表面；P3-肿瘤侵犯壁层胸膜和/或胸壁；Px-肺实质内与胸膜没有任何关系的肿瘤。2000年，日本肺癌学会基本认同Hammar分级法(除了Px)，但在伴脏层胸膜侵犯肿瘤T分期的划分上有所差异。还有学者将脏层胸膜受累定义为肿瘤浸润至距脏层胸膜边缘1mm以内或累及脏层胸膜边缘。2009年AJCC 7
th TNM分期系统正式采用了改良的Hammar分级法，即根据肿瘤组织与胸膜外弹力层之间的位置关系来判断是否存在胸膜受侵，如果明确癌组织穿透了外弹力层，则明确诊断为胸膜受侵，患者肿瘤分期至少为p T2a，是术后需要辅助化疗的指征。
[0004]世界卫生组织推荐肺癌诊断常规技术中，关于胸膜受侵的判断方法是普通弹力纤维染色，即采用特殊染色方法，将弹力纤维勾勒出来，再由病理医师显微镜下观察判读。其缺点是弹力纤维是黑色，与肿瘤细胞颜色一样，并且还常与胸膜碳沫混杂，难以准确辨别肿瘤细胞与弹力纤维的位置关系，造成胸膜受侵判读困难，医师间主观意见相左。另外可采用免疫组织化学染色，但是，单独免疫组织化学染色虽然可以借助抗原抗体复合物反应显示出肿瘤细胞，却无法显示弹力纤维，同样也难以准确显示肿瘤细胞与胸膜弹力纤维层的关系，造成肺癌胸膜受侵判读困难，从而难以准确分期，进而影响术后患者下一步治疗方案的选择。

技术实现思路

[0005]鉴于免疫组化染色与特殊染色(即普通弹力纤维染色)各自的步骤，联合二者进行套染尤为重要。因此，本专利技术的目的是提供一种联合免疫组化与特殊染色应用于病理组织切片的套染试剂盒及其使用方法，从而使染色过程简便快捷，方便在同一张切片上得到丰富对比性强的信号与信息，使诊断分期一目了然，准确性大幅提高。
[0006]本专利技术所涉及到的全部实验由贵州富兮生物科技有限公司合作支持。
[0007]具体而言，本专利技术的技术方案如下。
[0008]一方面，本专利技术提供一种用于病理组织切片的双染试剂盒，其包括以下试剂：
[0009]1)针对肿瘤标志物的第一抗体；
[0010]2)能够与第一抗体结合的第二抗体；
[0011]3)卢戈氏碘液，硫代硫酸钠溶液，醛复红溶液。
[0012]其中，所述第一抗体为鼠抗人或兔抗人的单克隆抗体；肿瘤标志物选自TTF-1、细胞角蛋白AE1/AE3、P40和P63等。并且，第一抗体在抗体保护液或抗体稀释液中，使用总蛋白浓度为3mg/mL。
[0013]所述第二抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG多克隆抗体。并且，第二抗体在抗体保护液或抗体稀释液中，使用总蛋白浓度为3mg/mL。
[0014]所述抗体保护液或抗体稀释液为本领域用于储存抗体的常规试剂，例如pH7.5并含有载体蛋白、非离子型去污剂以及作为防腐剂的0.09％叠氮化钠等的Tris缓冲液。
[0015]所述卢戈氏碘液含有0.01g/mL的碘和0.02g/mL的碘化钾。例如，1瓶5mL液体内含有0.05克的碘，0.1克的碘化钾。
[0016]所述硫代硫酸钠溶液含有0.05g/mL的硫代硫酸钠。例如，1瓶5mL液体内含有0.25克硫代硫酸钠。
[0017]所述醛复红溶液含有0.0001g/mL的碱性复红、0.119mol/mL HCl和1％(体积百分比)的三聚乙醛。例如，1瓶5mL液体内含有0.0005克碱性复红，0.119mol/mL HCl，0.05mL三聚乙醛。
[0018]卢戈氏碘液、硫代硫酸钠溶液、醛复红溶液可通过厂家直销或经销商途径购买。
[0019]除此之外，本专利技术提供的双染试剂盒还包括以下试剂：
[0020]4)DAB显色剂；
[0021]可采用DAB染液浓缩型(二氨基联苯胺(DAB)溶于有机溶液中的二氨基联苯胺盐酸盐)和DAB底物缓冲液(内含氧化氢与防腐剂缓冲液)染色时1:10配制得到；
[0022]5)EDTA抗原修复液；
[0023]6)过氧化氢水溶液。
[0024]所述EDTA抗原修复液具有pH 9.0，浓度为1mM。例如，选用丹麦DAKO公司、货号为DM828的EDTA抗原修复液。
[0025]所述过氧化氢水溶液的浓度为3％。
[0026]进一步地，本专利技术提供的双染试剂盒还包括以下试剂：
[0027]7)乙醇；
[0028]8)二甲苯。
[0029]所述乙醇包括100％乙醇和浓度分别为95％、85％、70％的乙醇水溶液。
[0030]另一方面，本专利技术还提供使用本专利技术的染色试剂盒对病理组织切片进行染色的双染方法，该双染方法包括：
[0031]A)将石蜡组织切片经脱蜡、水化处理、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断；
[0032]B)滴加第一抗体，孵育，PBS洗涤；滴加第二抗体，孵育，PBS洗涤；然后加入DAB显色剂，适时终止反应，水洗；
[0033]C)加入卢戈氏碘液，水洗；加入硫代硫酸钠溶液，水洗，乙醇洗涤；加入醛复红溶液，乙醇分化，水洗；
[0034]D)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[0035]在步骤A)中，石蜡组织切片的厚度为3-5μm，并且在70℃下烘烤2h；所述脱蜡包括二甲苯脱蜡2
×
10min；
[0036]所述水化处理包括经100％乙醇2
×
3min、95％乙醇水溶液2
×
3min、85％乙醇水溶
液1
×
3min的梯度乙醇水化，然后用水充分洗涤；
[0037]所述抗原修复包括将切片在pH 9.0、1mM的EDTA抗原修复液中加热到100℃保持1-5min，自然冷却至室温，水洗3
×
3min；
[0038]所述内源性过氧化物酶阻断包括将切片在3％的过氧化氢水溶液中在室温下孵育10min以去除内源性过氧化物酶，然后水洗3
×
3min，PBS洗3
×
3min。
[0039]关于步骤B)，其包括：滴加第一抗体，在湿盒中在室温下孵育40-60min或者在4℃下孵育过夜，PBS洗涤3
×
3min；然后滴加第二抗体，在湿盒中在室温下孵育10-15min，PBS洗涤3
×
3min；之后加入D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于病理组织切片的双染试剂盒，其包括以下试剂：1)针对肿瘤标志物的第一抗体；2)能够与第一抗体结合的第二抗体；3)卢戈氏碘液，硫代硫酸钠溶液，醛复红溶液。2.根据权利要求1所述的染色试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为鼠抗人或兔抗人的单克隆抗体；所述肿瘤标志物选自TTF-1、细胞角蛋白AE1/AE3、P40和P63；所述第一抗体在抗体保护液或抗体稀释液中，使用浓度为3mg/mL；优选地，所述第二抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG多克隆抗体；所述第二抗体在抗体保护液或抗体稀释液中，使用浓度为3mg/mL。3.根据权利要求1或2所述的染色试剂盒，其特征在于，所述卢戈氏碘液含有0.01g/mL的碘和0.02g/mL的碘化钾；所述硫代硫酸钠溶液含有0.05g/mL的硫代硫酸钠；所述醛复红溶液含有0.0001g/mL的碱性复红、0.119mol/mL HCl和1％的三聚乙醛。4.根据权利要求1至3中任一项所述的染色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：4)DAB显色剂；5)EDTA抗原修复液，pH9.0，浓度为1mM；6)过氧化氢水溶液，浓度为3％。5.根据权利要求1至4中任一项所述的染色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：7)乙醇；8)二甲苯；所述乙醇包括100％乙醇和浓度分别为95％、85％、70％的乙醇水溶液。6.使用权利要求1至5中任一项所述的双染试剂盒对病理组织切片进行染色的双染方法，所述双染方法包括：A)将石蜡组织切片经脱蜡、水化处理、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断；B)滴加第一抗体，孵育，PBS洗涤；滴加第二抗体，孵育，PBS洗涤；然后加入DAB显色剂，适时终止反应，水洗；C)加入卢戈氏碘液，水洗；加入硫代硫酸钠溶液，水洗，乙醇洗涤；加入醛复红溶液，乙醇分化，水洗；D)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。7.根据权利要求6所述的双染方法，其特征在于，在步骤A)中，石蜡组织切片的厚度为3-5μm，并且在70℃下烘烤2h；所述脱蜡包括二甲苯脱蜡2
×
10min；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：项征，
申请(专利权)人：项征，
类型：发明
国别省市：