一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法技术

本发明专利技术提供一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法，属于芯片制备领域。该芯片包括支撑层和设置在支撑层上的反应层，所述的反应层上设有若干流体微通道和反应微腔室，反应层的中间还设有进样口。本发明专利技术还提供一种自吸阀区隔式芯片的制备方法。本发明专利技术还提供一种基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法，可在10min内完成检测,变异系数小，最低检测浓度为46.8CFU/mL，加标回收率达到98.08％，灵敏度高，稳定性好。稳定性好。稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法


[0001]本专利技术属于芯片制备领域，具体涉及一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法。

技术介绍

[0002]单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，L.monocytogenes)为革兰氏阳性小杆菌，无芽孢，属兼性细胞内细菌，是导致食源性疾病爆发的最常见病原体之一。对理化因素抵抗力较强，常通过受污染的食物传播，如鸡蛋、果蔬、肉类和牛奶等。感染后能引起人、畜的李氏特菌病，主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多症。是最致命的食源性病原体之一，可造成二至三成的感染者死亡，其致死率甚至高过沙门氏菌及肉毒杆菌。此外，单核细胞增生李斯特菌不仅可以生存，而且还可以在冰箱中生长，这使食物储存和冷链运输变得困难。考虑到单核细胞增生李斯特氏菌对公共卫生的巨大威胁，迫切需要一种高度灵敏，特异的方法在食品中进行检测。
[0003]目前对单增李斯特菌的常见检测方法包括国家标准GB 4789.30-2016规定的传统分离培养鉴定法，分子生物学检测方法和免疫学检测方法等。(1)传统分离培养鉴定法是单增李斯特菌检测的“金标准”，该方法计数可靠，可以准确的鉴定单增李斯特菌并确定其浓度，具有成本较低的优势，便于普及应用，但检测周期过长，一般需要一周左右，无法满足副溶血性弧菌快速、灵敏的检测要求；(2)分子生物学检测方法中，常规聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法应用最为广泛，该方法通过扩增目标菌的基因序列实现对致病菌的检测，具有高灵敏度和特异性，在一定程度上能够满足灵敏检测的要求，但该方法同样需要较长时间的前增菌过程，且所需仪器设备昂贵，检测成本高，易出现假阳性结果；(3)免疫学检测方法中，酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)方法最为常见，该方法通过抗原与抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术实现对致病菌的检测，该方法与传统培养鉴定法相比提高了检测灵敏度和检测效率，但仍需要增菌和反复的孵育过程，检测步骤复杂，易出现交叉反应导致假阳性结果。因此，如何在短时间内实现对病原菌的灵敏检测，又不过分依赖设备就成为新一代检测技术发展的重点。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法，该芯片基于整体的负压环境及氧化石墨烯和FAM标记特异性适配体和HNB染料，能够快速、灵敏、简便地检测单增李斯特菌。
[0005]本专利技术首先提供一种自吸阀区隔式芯片，该芯片包括支撑层和设置在支撑层上的反应层，所述的反应层上设有若干流体微通道和反应微腔室，反应层的中间还设有进样口。
[0006]本专利技术首先提供一种自吸阀区隔式芯片的制备方法，包括：
[0007]步骤一：模具的制备
[0008]使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，使用旋涂机，将负性光刻胶涂布于硅晶片上，共计涂布两层，随后将硅晶片放在掩模下方的单面光刻机上，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，曝光后对硅晶片进行烘烤，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止，再次对模具进行烘烤，得到模具；
[0009]步骤二：自吸阀区隔式芯片的制作
[0010]使用三甲基氯硅烷处理模具，将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合去除气泡，倒入模具中，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，经加热板烘烤固化后，将聚二甲基硅氧烷从模具表面揭除，使用打孔器对加样孔进行打孔，最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子体处理，将被处理的平面相互贴合后烘烤固化形成自吸阀区隔式芯片。
[0011]优选的是，所述步骤一中硅晶片烘烤条件是60～70℃烘烤1～3min，随后是85～95℃下烘烤10min。
[0012]优选的是，所述步骤二中三甲基氯硅烷处理时间是10～20min。
[0013]优选的是，所述步骤二中聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B的质量比10：1。
[0014]优选的是，所述步骤二中混合聚二甲基硅氧烷组分去除气泡的条件是1500～2000rpm旋转1～2min。
[0015]优选的是，所述步骤二中烘烤固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。
[0016]优选的是，所述步骤二中芯片加热固化的温度是70～90℃，时间是30～40min。
[0017]本专利技术还提供一种基于自吸阀区隔式芯片的单增李斯特菌的检测方法，包括：
[0018]步骤一：氧化石墨烯的制备
[0019]将石墨粉加入H2SO4和硝酸钠的混合物中，于冰浴中搅拌，剧烈搅拌下，将高锰酸钾缓慢加入上述混合物，继续在30～40℃搅拌，然后加热至140～150℃搅拌，加入去离子水终止反应体系，在冰浴中用氢氧化钠中和H2SO4，将PH调至5.5～6，得到的浅黄色溶液经过离子过滤膜过滤去除大颗粒，然后在透析袋中透析2～3天去除盐分，得到氧化石墨烯；
[0020]步骤二：自吸阀区隔式芯片的前处理
[0021]使用透明胶带覆盖芯片顶部，置于真空泵中进行脱气处理；
[0022]步骤三：检测
[0023]将步骤一得到氧化石墨烯、FAM修饰的单增李斯特菌特异性适配体和HNB混合，作为阴性对照，通过底物进样孔在负压条件下使混合物均匀分布到样品孔中，随后将透明胶带揭除，置于加热板上加热，待底物完全干燥后，重新在芯片表面贴附胶带并置于真空泵中抽真空处理，将待测样品以及石蜡油注入总进样孔中，利用石蜡油将每个检测小室分开，反应后，将芯片置于小动物成像仪中拍摄荧光图像。
[0024]优选的是，所述步骤三的氧化石墨烯浓度为0.4～0.5mg
·
mL-1
,FAM修饰的单增李斯特菌特异性适配体浓度为1～1.2μM,HNB的浓度为12.5μM。
[0025]本专利技术的有益效果
[0026]本专利技术提供一种自吸阀区隔式芯片、制备方法及单增李斯特菌的检测方法，该方法首先是制作芯片的模具，然后利用聚二甲基硅氧烷的可塑性通过加热固化，打孔，等离子
体处理等过程，依托模具制作自吸阀区隔式芯片，在芯片表面贴附透明胶带，置于真空泵中抽真空使得芯片内部形成负压环境。而后将HNB、FAM染料标记的单增李斯特菌特异性适配体和氧化石墨烯按一定比例混合，通过底物进样孔注入芯片中，由于大气压的作用使得混合物将均匀分布到各检测小室中。由于氧化石墨烯的荧光共振能量转移效应使得FAM的绿色荧光被淬灭，此时混合物只剩HNB的红色荧光。揭去表面的胶带，将含有底物的芯片置于加热板上干燥，待小室内底物完全干燥后，重新于芯片表面贴附胶带，置于真空泵中抽真空使得芯片内部形成负压环境。将含有病原菌的待检测样品通过进样孔注入芯片中，当存在目标细菌时，6-FAM标记的适体会捕获目标细菌，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自吸阀区隔式芯片，其特征在于，该芯片包括支撑层和设置在支撑层上的反应层，所述的反应层上设有若干流体微通道和反应微腔室，反应层的中间还设有进样口。2.根据权利要求1所述的一种自吸阀区隔式芯片的制备方法，其特征在于，包括：步骤一：模具的制备使用CorelDRAW X8设计自吸阀区隔式芯片的通道和腔室图案，然后将其印刷到一块透明膜上作为掩模，使用旋涂机，将负性光刻胶涂布于硅晶片上，共计涂布两层，随后将硅晶片放在掩模下方的单面光刻机上，调整掩模的位置，以使图案位于晶片的中间，曝光后对硅晶片进行烘烤，最后，用显影剂冲洗处理过的硅晶片，直至模具图形完全出现为止，再次对模具进行烘烤，得到模具；步骤二：自吸阀区隔式芯片的制作使用三甲基氯硅烷处理模具，将聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B混合去除气泡，倒入模具中，将螺栓和螺母拧到一端齐平，然后将齐平端向下放置在模具的阀门位置，经加热板烘烤固化后，将聚二甲基硅氧烷从模具表面揭除，使用打孔器对加样孔进行打孔，最后，对聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同时使用等离子体处理，将被处理的平面相互贴合后烘烤固化形成自吸阀区隔式芯片。3.根据权利要求2所述的一种自吸阀区隔式芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤一中硅晶片烘烤条件是60～70℃烘烤1～3min，随后是85～95℃下烘烤10min。4.根据权利要求2所述的一种自吸阀区隔式芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤二中三甲基氯硅烷处理时间是10～20min。5.根据权利要求2所述的一种自吸阀区隔式芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤二中聚二甲基硅氧烷组分预固剂A和交联剂B的质量比10：1。6.根据权利要求2所述的一种自吸阀区隔式芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤二中混合聚二甲基硅氧烷组分去除气泡的条件是15...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娟，赵超，郭媛媛，李娟，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：