一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法技术

本发明专利技术涉及一种甾体激素类代谢物的定性、定量分析方法。本发明专利技术基于组合衍生化和LC-HRMS/MS的方法实现甾体激素类代谢物的定性分析；基于组合衍生化与2D LC-MS/MS的方法实现甾体激素类代谢物的定量分析。本发明专利技术所述定性、定量分析时间短，分析物质多，检测灵敏度高，能够用于挖掘未知甾体激素。能够用于挖掘未知甾体激素。

【技术实现步骤摘要】
一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法


[0001]本专利技术涉及代谢物分析
，具体涉及一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法。

技术介绍

[0002]目前临床上测量激素物质的含量水平的分析方法依赖于免疫分析，即包括放射免疫分析法，通过放射性标记抗原与标准品抗原或样本中未被标记的抗原对限定的特异性抗体的竞争结合反应。或者非同位素标记的免疫分析技术，化学发光、电化学发光、酶放大化学发光、荧光免疫、金属免疫分析等。但这些方法具有不确定的特异性，而其对于一些化合物灵敏度也不符合要求，并且每一次测定需要用血200μL，只能得到单一物质的含量，对于结构较为相似的物质，并且在低浓度的范围内，缺乏分析精度，容易造成诊断错误，例如在儿科诊断的过程中，常由于分析物含量较低，无法提供诊断依据。或测量绝经前后期的女性睾酮含量时，免疫分析法无法测定睾酮的准确含量等，同时免疫分析测定时样本未经过一定步骤的前处理，导致测量值受到基质效应以及人为测定的影响较大，这种误差也无法通过内标进行校正。若生物样本的激素物质浓度超过检测试剂盒测量范围，便无法准确测定物质含量。

技术实现思路

[0003]本专利技术的解决的技术问题在于提供一种甾体激素类代谢物的定性和定量分析方法。本专利技术所述分析时间短，分析物质多，检测灵敏度高，能够用于挖掘未知甾体激素。
[0004]为解决本专利技术的技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种甾体激素类代谢物的定性分析方法，包括以下步骤：
[0006]1)以水解酶对样品水解，利用反相碳18固相萃取96孔板(Waters Sep-Pak tC18 100mg)提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
[0007]2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤1)得到的待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品；采用氘代吉拉德试剂P与氘代丹磺酰氯对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品；
[0008]3)将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合，采用高分辨Q Exactive Orbitrap型质谱，利用ddms2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰；
[0009]4)推算分子组成；
[0010]选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在
±
0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物，将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；
[0011]选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在
±
0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物，将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第二甾体激素待识别物的分子组成。
[0012]优选的是，步骤1)所述样品包括尿液、血液。
[0013]优选的是，步骤3)标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合体积比为1:1。
[0014]优选的是，步骤3)所述报告离子包括：吉拉德试剂P类衍生物的报告离子80.0495及85.0809；丹磺酰氯类衍生物的报告离子171.1043及 177.1419。
[0015]优选的是，步骤4)所述环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构包含：24个C原子、至少含有一个O原子、有且仅含有3个N原子，符合不饱和度公式Ω≥9.5+N，N为自然数。
[0016]优选的是，步骤4)所述环戊烷多氢菲与Dns试剂结合的基本结构包含： 29个C原子、至少含有三个O原子、有且仅含有含有1个N原子、S原子，并且符合不饱和度公式Ω≥13.5+N，N为自然数。
[0017]本专利技术还提供了一种甾体激素类代谢物的定量分析方法，包括以下步骤：
[0018](1)以水解酶对样品水解，利用沃特世碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；
[0019](2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤(1)得到的待测样品分别进行衍生化，得到吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品；
[0020](3)将步骤(2)得到的吉拉德试剂P类衍生化样品和丹磺酰氯类衍生化样品进行二维液相分析：
[0021]所述二维液相分析的两个色谱柱为安捷伦高分辨碳18色谱柱，连接方式为平行柱分析；所述二维液相分析的流动相分别是：流动相A和流动相 B，所述流动相A为含0.1％的甲酸和10mM的甲酸铵的水溶液，所述流动相B为含0.1％的甲酸和1mM的氟化铵的甲醇与乙腈体积比为1:1的混合溶液；
[0022](a)取10μL丹磺酰氯类衍生化样品，0～3min以100％的水相A为流动相以0.5ml/min的速度进行上样，流动相直接流进废液
[0023](b)取10μL吉拉德试剂P类衍生化样品，流速0.5mL/min，按照以下条件进行上样分析：
[0024]0～2min，流动相A的比例为85～78％；
[0025]2～4min，流动相A的比例为78～75％％；
[0026]4～6min，流动相A的比例为75～70％；
[0027]6～7min，流动相A的比例为70～70％；
[0028]7～8min，流动相A的比例为70～65％；
[0029]8～10min，流动相A的比例为65～60％；
[0030]10～12min，流动相A的比例为60～60％；
[0031]12～12.1min，流动相A的比例为60～85％；
[0032]12.1～12.5min，流动相A的比例为85～85％；
[0033]12.5～12.6min，流动相A的比例为85～25％；
[0034]12.6～13min，流动相A的比例为25～25％；
[0035]13～17min，流动相A的比例为25～23％；
[0036]17～18min，流动相A的比例为23～20％；
[0037]18～19min，流动相A的比例为20～18％；
[0038]19～20min，流动相A的比例为18～16％；
[0039]20～20.5min，流动相A的比例为16～10％；
[0040]20.5～20.6min，流动相A的比例为10～100％；
[0041]20.6～21min，流动相A的比例为100～100％；
[0042]流动相开始运行梯度的最开始1min，流动相直接进废液；1min以后，流动相进质谱；
[0043](4)二维液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甾体激素类代谢物的定性分析方法，包括以下步骤：1)以水解酶对样品水解，利用反相碳18固相萃取96孔板提取水解后的样品中甾体激素，挥干后得待测样品；2)采用吉拉德试剂P与丹磺酰氯对步骤1)得到的待测样品进行衍生化，得到未标记的衍生化样品；采用氘代吉拉德试剂P与氘代丹磺酰氯对待测样品进行衍生化标记，得到标记的衍生化样品；3)将标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合，采用高分辨Q Exactive Orbitrap型质谱，利用数据依赖性二级质谱扫描ddMS2的数据采集模式，采集甾体激素的一级及二级质谱数据，利用MS-DIAL进行峰对齐、峰提取，筛选出含报告离子的母离子峰；4)推算分子组成；选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构，吉拉德试剂P结合物与氘代吉拉德试剂P结合物出峰时间在
±
0.2min内，且子离子裂解符合GP类甾体激素裂解规律的物质作为第一甾体激素待识别物；将所述第一甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第一甾体激素待识别物的分子组成；选取分子组成的精确质量误差在5ppm以内并包含基本的环戊烷多氢菲与丹磺酰氯结合的基本结构，丹磺酰氯结合物与氘代丹磺酰氯结合物出峰时间在
±
0.4min内的物质作为第二甾体激素待识别物；将所述第二甾体激素待识别物的二级质谱数据与甾体激素标准物质的二级质谱数据进行对比，同时比对与标准物质的色谱行为，确定第二甾体激素待识别物的分子组成。2.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤1)所述样品包括尿液、血液。3.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤3)标记的衍生化样品与未标记的衍生化样品混合体积比为1:1。4.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤3)所述报告离子包括：吉拉德试剂P类衍生物的报告离子80.0495及85.0809；丹磺酰氯类衍生物的报告离子171.1043及177.1419。5.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤4)所述环戊烷多氢菲与吉拉德试剂P结合的基本结构包含：24个C原子、至少含有一个O原子、有且仅含有3个N原子，符合不饱和度公式Ω≥9.5+N，N为自然数。6.根据权利要求1所述的定性分析方法，其特征在于，步骤4)所述环戊烷多氢菲与Dns试剂结合的基本结构包含：29个C原子、至少含有三个O原子、有且仅含有含有1个N原子、S原子，并且符合不饱和度公式Ω≥13.5+N，N为...

【专利技术属性】
技术研发人员：再帕尔阿不力孜，张瑞萍，汪满江措，臧清策，贺玖明，刘家兴，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：