一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的KASP标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的KASP标记及其应用，属于分子生物技术领域。其中，用于扩增所述KASP标记的引物核苷酸序列如序列表中序列1

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的KASP标记及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的KASP标记及其应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]洋葱(Allium cepa L.)为石蒜科葱属二年生蔬菜，是世界上广泛种植的重要蔬菜之一，种植面积仅次于番茄和马铃薯，总产量在所有蔬菜作物中居第三位(FAO，2018)。洋葱是我国重要的出口创汇特色蔬菜，面积和产量均居世界首位。洋葱不仅可鲜食，还大量用于加工制品，富含多种硫化物和糖类是其具有独特风味的主要原因。从医疗保健角度来讲，洋葱具有抗血栓、促进血液循环、抗癌等功效，其营养和医疗价值逐渐被全世界所公认。
[0004]洋葱起源于中亚地区，在我国栽培历史较短，品种资源相对匮乏。在杂交种选育方面远远落后于日本、美国、荷兰等国家。目前高端品种通常需要进口，种子价格是国产同类型品种的2～3倍，甚至更多。随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加，生产上主要以品种引进和常规品种选育为主，缺少具有我国自主知识产权的杂交一代品种，需要花费大量的外汇从国外进口种子，使生产成本居高不下。
[0005]洋葱是最早应用细胞质雄性不育系进行杂交种选育的蔬菜作物，杂交种生产主要利用质核互作的CMS-S雄性不育系统，其不育性是由不育的细胞质因子(S)和一对核隐性单基因(msms)共同控制的，不育系的基因型为S(msms)，保持系的基因型为N(msms)。因此杂交种选育的关键环节是不育系及其保持系的选育。由于洋葱是两年生异花授粉蔬菜，自交衰退严重，通过传统的测交方法鉴定雄性不育基因型需要4～8年时间，具有费时、费工、效率低的问题。利用常规育种与分子标记辅助育种相结合能够。利用细胞质雄性不育基因分子标记辅助选择技术，可以大大提高洋葱雄性不育系及其保持系的选择效率。
[0006]由于洋葱基因组DNA巨大(17.9pg)，每1条染色体上的核苷酸有15,290Mbp，是玉米基因组的6倍、番茄的16倍、拟南芥的107倍。CMS-S系统的核基因标记与其他大多数蔬菜作物相比研究进展缓慢，但也取得了实质性进展。目前比较有效的几个分子标记用于核基因Ms位点的分子标记。AOB272、OPT和PsaO三个标记在与之连锁遗传的分离群体中，能够用于保持系的选育，但不能应用于未知背景的群体，只能减少分离群体测交的工作量，不能缩短选育进程。本研究团队开发的与洋葱雄性不育基因ms和育性恢复基因Ms紧密连锁的共分离SCAR标记，可以鉴定出洋葱单株在Ms位点的基因型，但是需要两次PCR扩增才可以确定。最近，Huo等(2015)开发出共显性的PCR分子标记AcSKP1，可通过一次PCR鉴定Ms位点的基因型。这些标记的开发与应用有效的避免了保持系筛选的盲目性，提高了选择效率。但是，专利技术人发现，这些标记均以PCR为基础，然后进行电泳来判断细胞核的育性，虽然较田间鉴定快速的多，但是每次最多只能检测96个样品，对于大量样本检测来说，检测效率偏低，扩增
结果不太稳定，具有一定的局限性。

技术实现思路

[0007]针对上述现有技术，经长期的技术与实践探索，本专利技术提供一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的KASP标记及其应用，其可用于辅助选育洋葱雄性不育系和配套保持系，具有高通量、低成本和高准确性的特点，将在洋葱细胞核基因型大量群体的检测中发挥重要作用，因此具有良好的实际应用之价值。
[0008]本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的KASP标记，用于扩增所述KASP标记的引物核苷酸序列如下：
[0010]SEQ ID NO.1(KASP-MS)：
[0011]5'-GCAACATCTTCTTCTACTTGTTGTATAGA-3'；
[0012]SEQ ID NO.2(KASP-ms)：
[0013]5'-GCAACATCTTCTTCTACTTGTTGTATAGT-3'；
[0014]SEQ ID NO.3(KASP-C)：
[0015]5'-TCATTTATATGGRTAAAAACTGCTGATGGC-3'。
[0016]优选的，序列1和序列2的5'端还设计有荧光标签；
[0017]更优选的，所述序列1的5'端设计有第一荧光标签，所述序列2的5'端设计有第二荧光标签，所述第一荧光标签和第二荧光标签并不相同；在本专利技术的一个具体实施方式中，所述第一荧光标签可以为FAM，所述第二荧光标签可以为HEX。
[0018]因此，所述用于扩增所述KASP标记的引物核苷酸序列如下：
[0019]SEQ ID NO.4：下划线部分为FAM荧光标签序列
[0020]5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCGCAACATCTTCTTCTACTTGTTGTATAGA-3'；
[0021]SEQ ID NO.5：下划线部分为HEX荧光标签序列
[0022]5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGAGCAACATCTTCTTCTACTTGTTGTATAGT-3'；
[0023]SEQ ID NO.3：
[0024]5'-TCATTTATATGGRTAAAAACTGCTGATGGC-3'。
[0025]本专利技术的第二个方面，提供上述KASP标记的扩增引物，所述扩增引物包括：
[0026]SEQ ID NO.1(KASP-MS)：
[0027]5'-GCAACATCTTCTTCTACTTGTTGTATAGA-3'；
[0028]SEQ ID NO.2(KASP-ms)：
[0029]5'-GCAACATCTTCTTCTACTTGTTGTATAGT-3'；
[0030]SEQ ID NO.3(KASP-C)：
[0031]5'-TCATTTATATGGRTAAAAACTGCTGATGGC-3'。
[0032]优选的，序列1和序列2的5'端还设计有荧光标签；
[0033]更优选的，所述序列1的5'端设计有第一荧光标签，所述序列2的5'端设计有第二荧光标签，所述第一荧光标签和第二荧光标签并不相同；在本专利技术的一个具体实施方式中，所述第一荧光标签可以为FAM，所述第二荧光标签可以为HEX。
[0034]因此，所述用于扩增所述KASP标记的引物核苷酸序列如下：
[0035]SEQ ID NO.4：下划线部分为FAM荧光标签序列
[0036]5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCGCAACATCTTCTTCTACTTGTTGTATAGA-3'；
[0037]SEQ ID NO.5：下划线部分为HEX荧光标签序列
[0038]5'-GAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的KASP标记，其特征在于，用于扩增所述KASP标记的引物核苷酸序列如序列表中序列1-3所示。2.如权利要求1所述的KASP标记，其特征在于，所述序列1和序列2的5'端还设计有荧光标签；优选的，所述序列1的5'端设计有第一荧光标签，所述序列2的5'端设计有第二荧光标签，所述第一荧光标签和第二荧光标签并不相同；进一步优选的，所述第一荧光标签为FAM，所述第二荧光标签为HEX。3.权利要求1所述的KASP标记的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物其核苷酸序列如序列表中序列1-3所示；优选的，序列1和序列2的5'端还设计有荧光标签；更优选的，所述序列1的5'端设计有第一荧光标签，所述序列2的5'端设计有第二荧光标签，所述第一荧光标签和第二荧光标签并不相同；进一步优选的，所述第一荧光标签为FAM，所述第二荧光标签为HEX。4.权利要求1或2所述KASP标记和/或权利要求3所述KASP标记的扩增引物在快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性中的应用。5.一种快速鉴定大量群体洋葱细胞核育性的方法，其特征在于，所述方法包括：基于权利要求3所述KASP标记的扩增引物对待测洋葱材料的基因组DNA进行PCR扩增；检测并判断PCR扩增产物中多态位点的基因型。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，6...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨妍妍，霍雨猛，刘冰江，侯卫华，常旭长，吴雄，
申请(专利权)人：山东省农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：