一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法技术

本发明专利技术公开了一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，以包含Rfo基因的Scalfold 131序列为目标模板，与甘蓝型油菜参考基因组进行比对，获取存在插入/缺失的同源序列，并将甘蓝型油菜序列在白菜、甘蓝和多个甘蓝型油菜基因组中进行比对，获取在这些物种中高度保守的同源序列。在这些序列插入/缺失两侧高度保守的区域设计特异引物，将这些特异引物在Ogu

【技术实现步骤摘要】
一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学及油菜育种
，具体涉及一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法。

技术介绍

[0002]萝卜质雄性不育（Ogura CMS，Ogu-CMS）最初在萝卜（Raphanus sativus）中发现，因不育性稳定，以其为不育系统生产的杂交种具有较高的纯度(Ogura 1968) (Yu et al 2016b)。近年来，萝卜质雄性不育系统在芸薹属作物中得到广泛应用(Yu et al 2016b)。但在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜等芸薹属作物中不存在萝卜质不育系的恢复源，因此恢复系选育成为萝卜质不育系统在芸薹属作物中利用的重点。研究人员通过种间杂交、细胞融合和回交等手段，将萝卜中的恢复基因（Rfo）相继导入到甘蓝型油菜、甘蓝和白菜，而分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）为恢复基因的转育提供了快速、准确和高效的工具(Heyn 1976; Heath et al 1994; Kirti et al 1995; Primard-Brisset et al 2005; 陈卫江 et al 2013; Yu et al 2016a; Yu et al 2016b; Wei et al 2019)。
[0003]然而，由于甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中的恢复基因都为外源导入，现有开发分子标记技术完全基于萝卜导入片段设计，检测过程中仅扩增萝卜外源导入片段，因缺乏竞争模板，当PCR反应体系中存在微量污染时，容易出现假阳性(Yu et al 2016; 杨其东 et al 2016)。同时在大规模样品PCR检测过程中，样品的反应条件难以达到一致，样品之间也存在交叉感染污染问题，假阳性和假阴性问题难以避免，从而导致检测结果出现偏差(夏志辉 et al 2009)。竞争性 PCR 是目前公认较好的消除PCR假阳性和假阴性方法之一：在PCR反应体系中，竞争模板和目标模板竞争同一引物，且两种模板的PCR产物大小具有差异，可通过电泳进行区分。理论上每个PCR反应中都存在竞争模板，因此没有任何扩增产物的为PCR假阴性。此外，当PCR反应体系中存在微量污染时，因竞争模板的总量是目标模板污染量的上千倍，微量的污染不会被检测到，从而有效的降低PCR假阳性(Mariasegaram et al 2006; 夏志辉 et al 2009)。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供了一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，以解决目前因PCR假阳性和假阴性而导致分子标记辅助选择和OGU CMS系统杂交种纯度鉴定结果偏差等问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，以包含Rfo基因的Scalfold 131序列(GenBank Accession AJ550021)为目标模板(Brown et al 2003)，与甘蓝型油菜参考基因组进行比对，获取存在插入/缺失的同源序列，在这些序列插入/缺失的两侧的高度保守区域设计特异引物，将这些特异引物在Ogu-CMS恢复系与不育系和常
规甘蓝型油菜中进行筛选，并通过Ogu-CMS恢复基因分离群体进行验证，最终获得与萝卜质恢复基因共分离的竞争性INDEL标记；具体包括如下步骤：S1、根据已公布的萝卜参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），提取包含Rfo基因(Brown et al 2003)的Scalfold 131序列(GenBank Accession AJ550021)；S2、将包含Rfo基因的127 Kb序列与甘蓝型油菜Darmor-bzh参考基因组（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）进行比对，共获得12个存在插入/缺失差异，且两侧序列保守的位点；S3、将上述位点的序列在白菜、甘蓝以及多个甘蓝型油菜基因组中进行比对（http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/），获得8个在这些基因组中高度保守的位点，并在这些位点开发特异引物，共设计12对特异引物；S4、利用12对特异引物在多个OGU CMS恢复系、OGU CMS不育系以及正常甘蓝型油菜中扩增，实现多态性竞争性INDEL分子标记的筛选，筛选标准为：1）所有恢复系中带型一致；2）所有不育系和常规甘蓝型油菜材料带型一致；3）在恢复系和不育系之间存在多态性；4）恢复系的扩增产物包括萝卜导入片段（目标模板）扩增产物和甘蓝型油菜本底序列（竞争模板）扩增产物，而不育系和恢复系中有且仅有竞争模板扩增产物；5）目标模板扩增产物于竞争模板扩增产物之间差异大于5bp，方便采用琼脂糖凝胶电泳进行区分；结果显示：其中，一对引物CIN6具有多态性，在6个恢复系中CIN6扩增产物具有两条带，分别对应萝卜导入片段（目标模板扩增产物）和甘蓝型油菜本底序列扩增片段（竞争模板扩增产物），而在不育系和常规甘蓝型油菜材料中仅有竞争模板扩增产物；S5、通过Ogu-CMS恢复基因分离群体实现多态性竞争性INDEL分子标记的验证；具体的，将CIN6在OGU CMS育性分离的F2和BC4群体中进行扩增，结果显示CIN6与F2和BC1F1群体的育性呈现共分离，表明CIN6为与OGU CMS恢复基因紧密连锁的INDEL标记，可用于OGU CMS恢复系选育的分子标记辅助选择。
[0006]本专利技术为外源导入片段检测分子标记设计提供了一个新的方法，同时所得的分子标记CIN6可用于Ogu-CMS恢复系选育分子标记辅助育种以及OGU CMS系统杂交种纯度鉴定。
[0007]本专利技术具有以下有益效果：1）本专利技术涉及的分子标记开发方法可为萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记，以及外源导入片段竞争性INDEL分子标记开发提供技术支撑。
[0008]2）本专利技术获得分子标记CIN6为竞争性INDEL标记，可有效的降低PCR假阳性和假阴性。
[0009]3）本专利技术获得分子标记CIN6可用于甘蓝型油菜萝卜质恢复系选育分子标记辅助选择，以及OGU CMS系统杂交种纯度鉴定。
[0010]4）本专利技术标记开发基于的竞争模板序列在甘蓝型油菜中高度保守，因此在不同甘蓝型油菜背景中具有广泛的适用性。
附图说明
[0011]图1为CIN6标记序列的比对示意图。
[0012]图2为CIN6引物筛选示意图；图中：a.采用4%的琼脂糖凝胶进行检测；b.采用6%聚丙烯酰胺凝胶进行检测；恢复系为
不同背景萝卜质恢复系，不育系为H28A。
[0013]图3为CIN6在育性分离群体种验证结果示意图。
[0014]图4为CIN6在Ogu-CMS系统在杂交种纯度鉴定中的应用结果示意图：图中：a.田间取样鉴定结果。b.室内播种取样鉴定结果。
具体实施方式
[0015]下面结合具体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，其特征在于：以包含Rfo基因的Scalfold 131序列(GenBank Accession AJ550021)为目标模板(Brown et al 2003)，与甘蓝型油菜参考基因组进行比对，获取存在插入/缺失的同源序列，在这些序列插入/缺失的两侧的高度保守区域设计特异引物，将这些特异引物在Ogu-CMS恢复系与不育系和常规甘蓝型油菜中进行筛选，并通过Ogu-CMS恢复基因分离群体进行验证，最终获得与萝卜质恢复基因共分离的竞争性INDEL标记。2.如权利要求1所述的一种萝卜细胞质不育恢复系共分离的竞争性INDEL分子标记的开发方法，其特征在于：具体包括如下步骤：S1、根据已公布的萝卜参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），提取包含Rfo基因(Brown et al 2003)的Scalfold 131序列(GenBank Accession AJ550021)；S2、将包含Rfo基因的127 Kb序列与甘蓝型油菜Darmor-bzh参考基因组进行比对，共获得12个存在插入/缺失差异，且两侧序列保守的位点；S3、将上述位点的序列在白菜、甘蓝以及多个甘蓝型油菜基因组中进行比对，获得8个在这些基因组中高度保守的位点，并在这些位点开发特异引物，共设计12对特异引物；S4、利用12对特异引物在多个OGU CMS恢复系、OGU CMS不育系以及正常甘蓝型油菜中扩增，实现多态性竞争性IN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宝，李莓，王同华，郭一鸣，刘新红，张瑶婷，周兴，曲亮，
申请(专利权)人：湖南省作物研究所，
类型：发明
国别省市：