本发明专利技术涉及微卫星位点检测技术领域，具体涉及用于检测微卫星不稳定性状态的方法及系统，通过对癌变组织样本进行DNA提取，片段化处理，末端修复，接头连接；再经扩增、杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析。与现有技术相比，本发明专利技术采用目前成熟的二代测序技术获取被测试者肿瘤组织的遗传信息，可进行单一肿瘤组织分析，不依赖对照样本，打破了微卫星检测的局限性，可适用于多个基因组合，不需要专门设计MSI位点探针，适用性强，并且可以节约检测成本，具有高效、系统、经济简便性，并且提高了检测的敏感性。并且提高了检测的敏感性。并且提高了检测的敏感性。
【技术实现步骤摘要】
用于检测微卫星不稳定性状态的方法及系统
[0001]本专利技术涉及微卫星位点检测
，具体涉及用于检测微卫星不稳定性状态的方法及系统。
技术介绍
[0002]微卫星（Microsatellite,简称MS）序列又称短串联重复序列（Short tandem repeats, STRs）或简单重复串联序列（Simple Sequence Repeat, SSR），广泛存在于原核及真核基因组中，是由10~50个1~6个核苷酸组成的重复单元串联而成的具有高度多态性的简单串联重复序列。当人体的错配修复（Mismatch repair, 简称MMR）机制发生缺陷时，MS序列会出现长度的变化，成为微卫星不稳定性（Microsatellite instability, 简称MSI）。大量研究证明，微卫星不稳定性与肿瘤的发生相关，尤其是结直肠癌等胃肠道癌症，并在肿瘤的治疗和预后的过程中具有重要的作用。
[0003]美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，简称NCCN）结直肠癌指南中提到MSI检测应在所有结直肠癌史的病人中进行，可以作为结直肠癌预后的良好标志物并且MSI-H的结直肠癌II期病人有较好的预后。
[0004]FDA在2017年5月批准默沙东PD-1单抗Keytruda用于治疗携带MSI-H或错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者，证明了MSI-H可以作为一种独立于肿瘤发病位置的泛癌种癌症标志物。紧接着2017年8月批准了nivolumab用于曾接受过氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康化疗发生疾病进展或对上述药物不耐受的dMMR或MSI-H的成年人或12岁以上儿童转移性结直肠癌患者的治疗；2018年7月又批准了Ipilimumab联合nivolumab，用于治疗12岁及以上的MSI-H或dMMR并且在使用氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康治疗后疾病进展的转移性结直肠癌患者。可见MSI检测对于癌症患者的重要性。
[0005]目前，市场上对于肿瘤MSI的诊断方法多数停留在单个肿瘤单个或几个位点的检测水平，这些方法都存在不同的缺陷，免疫组化的方法特异性和可重复性较低，对样本质量要求高，操作也比较复杂；PCR的方法通常选择5-11个单核苷酸重复位点，长度为25bp左右，PCR扩增后通过毛细管电泳测量其长度分布区间来确定样本的微卫星(不)稳定状态，为目前的金标准检测方法，但需要额外的检测样本来进行，且需要患者的正常组织作为对照来进行状态判定，因此从操作角度上而言并不便捷。所以，目前的MSI的检测方法难以满足目前检测样本数量大、检测位点多、分布广、检测准确性高等检测要求。因此，如何建立一种高效便捷的MSI检测体系，并寻找高度灵敏性及特异性的用于检测结直肠癌相关的MSI位点已成为目前需要解决的问题。
技术实现思路
[0006]为了克服上述技术缺陷的不足，本专利技术提供了用于检测微卫星不稳定性状态的方法及系统，可实现样本中多个微卫星位点和多个疾病相关基因的同时检测，能够针对所检测的样本给出更加全面的预后、治疗、排查等方面的结论和建议。
[0007]用于检测微卫星不稳定性状态的系统，关键在于：包括用于对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析的MSI模型，所述MSI模型包括MSI模型准备模块，用于判别样本微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点；数据质控模块，用于对靶向捕获数据进行质控，进行微卫星不稳定性检测；MSI状态检测模块，用于扫描样本比对结果中所有有效位点，对该样本的微卫星位点状态进行预测，根据MSI score来判别样本的MSI状态。高灵敏度位点如下表1所示：表1
序号微卫星位点基因区域重复单元重复长度试剂盒中检测长度（bp）1NR21SLC7A8chr14:23652347-23652367A213412NR22STT3Achr11:125490766-125490786T213413NR24ZNF2chr2:95849362-95849384T233434NR27BIRC3chr11:102193509-102193534A263465BAT25KITchr4:55598212-55598236T253606BAT26MSH2chr2:47641560-47641586A273477Mono27MAP4K3chr2:39536690-39536716T273418D2S123MSH2chr2:51286141-51286150AC53259D5S346APCchr5:112213679-112213718TG2034010D17S250BRCA1chr17:37152193-37152206TA732711PentaC-chr9:33834923-33834942AAAAG432412PentaD
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chr21:46458621-46458635AAAAG332313chr1_26646611CD52chr1:26646611-26646626A1633614chr1_31732677SNRNP40chr1:31732677-31732687A1133115chr1_39900058MACF1chr1:39900058-39900074T1733716chr1_44805012ERI3chr1:44805012-44805029A1833817chr1_54395673HSPB11chr1:54395673-54395690A1833818chr1_64245841ROR1chr1:64245841-64245853T1333319chr1_66037973LEPRchr1:66037973-66037999T2734720chr1_94497662ABCA4chr1:94497662-94497671T1033021chr1_113657018LRIG2chr1:113657018-113657031T1433422chr1_114281007PHTF1chr1:114281007-114281017A1133123chr1_148904052AK310441;LOC645166chr1:148904052-148904071A2034024chr1_201948138TIMM17A;RNPEPchr1:201948138-201948148A1133125chr1_237965133RYR2chr1:237965133-237965144T1233226chr2_32690253BIRC6chr2:32690253-32690271T1933927chr2_47635523MSH2chr2:47635523-47635535T1333328chr2_48032740MSH6chr2:48032740-48032752T1333329chr2_48605827FOXN2chr2:48605827-48605841T1533530chr2_109371849RANBP2chr2:109371849-109371863T1533531chr2_111886180B本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测微卫星不稳定性状态的系统，其特征在于：包括用于对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析的MSI模型，所述MSI模型包括MSI模型准备模块，用于判别样本微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点；数据质控模块，用于对靶向捕获数据进行质控，进行微卫星不稳定性检测；MSI状态检测模块，用于扫描样本比对结果中所有有效位点，对该样本的微卫星位点状态进行预测，根据MSI score来判别样本的MSI状态。2.使用权利要求1所述的用于检测微卫星不稳定性状态的系统来检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一、对肿瘤患者的癌变组织样本进行DNA提取，之后进行DNA片段化处理，末端修复加poly-A尾，进行接头连接；步骤二、将接头的DNA纯化后，加入PCR反应混合液进行扩增，将扩增产物纯化后，进行杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；步骤三、通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析。3.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤一中DNA末端修复加poly-A尾方法具体为：将体积比为（5-8）:（10-20）:100的“A”酶混合物、“A”缓冲液和片段化处理的DNA涡旋混匀后离心，放置在热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，65℃，30min，4℃，保持。4.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤一中接头连接具体为：将体积比为（3-5）:（25-30）:（3-8）:100的UMI标签的接头、连接缓冲液、连接酶和末端修复的DNA涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，4℃，保持。5.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中文库扩增具体为：将体积比为1：（2-5）：（4-7）的扩增引物、接头的DNA和2X PCR混合液，涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：98℃ 45s，循环1次；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环8次；72℃ 30s，循环1次；4℃ 1min，循环1次。6.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中纯化具体为：将DNA样本加入质量分数为80%wt的乙醇纯化后的磁珠，充分混合均匀后，室温静置5min后，置于磁力架静置2min，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，缓慢加入质量分数为80%wt的乙醇，静置30-60s，移除清液，干燥磁珠直到磁珠状态为表面不反光，然后用TE缓冲液重悬磁珠，充分混匀，室温静置1min，置于磁力架静置2min，待磁珠完全吸附至侧壁，将上清液移出待用。7.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙大伟，辛琳，张腾龙，陈鹏燕，段小红，师雅宁，王东亮，
申请(专利权)人：北京求臻医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：
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