盐芥盐诱导表达基因TsHKT1;2启动子的克隆与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2启动子的克隆与应用；本发明专利技术通过构建该启动子驱动GUS的植物表达载体TsHKT1；2::GUS，并经农杆菌花序侵染法转化拟南芥，对转基因拟南芥进行染色观察。结果表明，TsHKT1；2在拟南芥苗期叶维管束组织中微弱表达，成熟期也主要在莲座叶维管束中表达。此外，对盐芥各组织的相对荧光定量PCR结果表明，TsHKT1；2基因表达受盐诱导上调，并且在各组织中表达量较高。因此，该启动子是一种较为稳定的盐芥盐诱导上调启动子，可以在植物基因改造工程中作为功能元件驱动相关功能基因的表达，可能在盐胁迫过程中的作用最为关键。迫过程中的作用最为关键。迫过程中的作用最为关键。

【技术实现步骤摘要】
盐芥盐诱导表达基因TsHKT1;2启动子的克隆与应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和植物基因工程领域，涉及一种盐芥盐诱导表达基因 TsHKT1；2启动子的克隆与应用；尤其涉及一种盐芥盐诱导表达上调TsHKT1；2基因的启动子核苷酸编码序列的克隆，此启动子重组表达载体的构建，以及转入双子叶植物拟南芥中启动下游基因表达的方法。

技术介绍

[0002]土壤盐渍化是植物承受的最主要的环境胁迫之一，严重制约植物的生长，使得农作物的产量严重降低，危害国家的粮食安全。为了抵御土壤中盐离子的胁迫，植物体内产生了一系列的盐胁迫调控机制来适应环境。因此，了解植物如何响应外界盐胁迫的过程是十分重要的。HKT1类型的转运蛋白在植物盐胁迫过程中发挥了重要的作用。在模式植物拟南芥中，只存在一个HKT1类型的基因，即AtHKT1。而在盐生植物，也是拟南芥的近亲物种盐芥中，却存在着三个HKT1基因，分别是TsHKT1；1，TsHKT1；2， TsHKT1；3。研究这三个基因的功能和表达谱对于解析植物响应盐胁迫的过程是十分重要的。本专利技术主要针对TsHKT1；2的启动子进行分析。
[0003]常见的启动子可分为组成型启动子，组织特异型启动子和诱导型启动子。在一些情况下，一种类型的启动子可能兼有其他类型启动子的特性。诱导型启动子在植物基因工程中具有重要的功能，植物通过启动不同基因的表达可在一定范围内适应光、温、水等环境的变化。这些基因的启动子通常包含比较保守的顺式作用元件，利用这些保守元件可以推测新基因的可能功能，也可用这些环境应答基因的启动子与抗逆基因融合，从而使转基因植物更好地适应逆境。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对目前的研究现状，提供一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2启动子的克隆方法与应用。
[0005]为完成上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术涉及一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2，所述基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。
[0007]本专利技术还涉及一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2启动子，所述启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。
[0008]本专利技术还涉及一种含有所述TsHKT1；2启动子的重组表达载体。
[0009]优选地，所述重组表达载体为在植物GUS表达载体pCambia1305.1的酶切位点插入所述TsHKT1；2启动子得到的重组质粒；在所述重组表达质粒中，TsHKT1；2启动子连接在GUS基因的上游。
[0010]优选地，所述酶切位点为BamHⅠ和BglⅡ。
[0011]优选地，所述插入采用的扩增引物为：
[0012]FP2:TTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGCGTTTGTCAAACTCGATTGG
[0013]RP2:AAATTTACCCTCAGATCTGGAGAGATTTAGCATGTTGCGA。
[0014]本专利技术还涉及一种所述的TsHKT1；2启动子作为盐芥盐诱导上调启动子在植物基因改造工程中驱动目的基因表达的应用。
[0015]优选地，所述植物包括拟南芥。
[0016]优选地，将含有所述TsHKT1；2启动子的重组表达载体转化农杆菌感受态GV3101，利用花序侵染法进行植物的遗传转化；所收种子经多代潮霉素筛选，获得纯系转基因植株。
[0017]本专利技术还涉及一种所述的重组表达载体在植物抗盐机制中的应用。
[0018]本专利技术还涉及一种所述的盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2在盐芥中的表达分析方法，包括：
[0019]A.所述盐芥为：(1)萌发后4-10天的盐芥，经150-300mM NaCl处理2-30h；或 (2)低温春化后正常光照培养10-20天的盐芥，经20-40天的150-300mM NaCl处理；
[0020]B.设计对所述TsHKT1；2基因的相对荧光定量PCR的引物，如下：
[0021]上游引物：CTCTACTTCTCTCATTTCATTAACTTCAA
[0022]下游引物：GATCTGACTAGAAAGCTTGACATGATT；
[0023]C.以步骤A所得盐芥各组织RNA为模板进行荧光定量PCR反应，分析TsHKT1；2 基因在盐芥各组织中的表达。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0025]本专利技术克隆了盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2启动子，该启动子可作为构建植物表达载体时所使用的元件，驱动特定基因在植物中进行表达，从而研究或加强该基因在盐胁迫中的功能，进而为改善作物的农艺性状奠定基础。
附图说明
[0026]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0027]图1：TsHKT1；2启动子的顺式作用元件预测结果图；
[0028]图2：TsHKT1；2启动子驱动GUS报告基因表达载体pCambia1305.1的构建示意图；
[0029]图3：TsHKT1；2启动子驱动GUS报告基因表达载体pCambia1305.1的转基因拟南芥的 GUS染色图(其中A、C图为对照组的GUS染色图，B、D图为200mM NaCl处理24h后的GUS 染色图；A、B中Ⅰ为拟南芥幼苗期，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为Ⅰ中子叶、下胚轴和根部放大图；C、D中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、
Ⅴ
、
Ⅵ
分别为拟南芥成熟期的根、茎、莲座叶、茎生叶、花和角果)；
[0030]图4：盐芥中TsHKT1；2转录水平的测定(其中A图为盐芥7天幼苗的TsHKT1；2相对表达结果，B图为成熟期盐芥的TsHKT1；2相对表达结果)。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。
[0032]一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2启动子的生物信息学分析，
[0033]1)从phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上获取盐芥 TsHKT1；2基因启动子序列信息；
[0034]2)对TsHKT1；2启动子中可能存在的顺式作用元件进行预测，利用PlantCARE在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)；
[0035]3)分析存在的顺式作用元件的功能；
[0036]一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2启动子的克隆方法，该启动子序列如 SEQ.ID.NO:2所示，共包含3151bp。克隆方法具体包括以下步骤：
[0037](1)利用CTAB法提取盐芥整株DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2，其特征在于，所述基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。2.一种盐芥盐诱导表达基因TsHKT1；2启动子，其特征在于，所述启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。3.一种含有如权利要求2所述TsHKT1；2启动子的重组表达载体。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物GUS表达载体pCambia1305.1的酶切位点插入所述TsHKT1；2启动子得到的重组质粒；在所述重组表达质粒中，TsHKT1；2启动子连接在GUS基因的上游。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述酶切位点为BamHⅠ和BglⅡ。6.如权利要求4或5所述的重组表达载体，其特征在于，所述插入采用的扩增引物为：FP2:TTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGCGTTTGTCAAACTCGATTGGRP2:AAATTTACCCTCAGATCTGGAGAGATTTAGCATGTTGCGA。7.一种如权利要求2所述的TsHKT1；2启动子作为盐芥盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：左开井，姚丹，熊雅丽，吕萌荔，李建福，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：