用于治疗CD30+肿瘤的CAR-CD30T细胞制造技术

本发明专利技术涉及用于治疗CD30+肿瘤如淋巴恶性肿瘤、白血病、实体瘤的第三代CAR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗CD30+肿瘤的CAR-CD30 T细胞


[0001]本专利技术涉及用于治疗CD30+肿瘤的CAR-CD30 T细胞。特别地，本专利技术涉及用于治疗CD30+肿瘤(如淋巴恶性肿瘤、白血病、实体瘤)的第三代CAR-CD30 T细胞。

技术介绍

[0002]众所周知，大多数化疗难以治愈的或多次复发的非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金淋巴瘤(HL)患者的预后仍然很差(1)。尽管同种异体HSCT(allo-HSCT)提供了治愈各种淋巴瘤亚型患者的潜力，但移植相关死亡率仍然很高，并且包括慢性移植物抗宿主病(GVHD)在内的长期后遗症会对生活质量产生实质性的负面影响(2)。
[0003]PD-1阻断对allo-HSCT后复发的淋巴瘤似乎非常有效，但经常伴有严重和难治性GVHD的快速发作(3)。CAR-T细胞正在成为这些患者的一种新型治疗方法。
[0004]CD30(Ki-1)是一种来源于肿瘤坏死因子受体超家族8(TNFRSF8)的细胞膜蛋白，其正常表达限于活化的T细胞和B细胞。在肿瘤细胞中，CD30的表达最常见于淋巴恶性肿瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、T细胞(4)或B细胞谱系 (5)的CD30+急性淋巴细胞白血病(ALL))。据报道，CD30在大多数成人非淋巴恶性肿瘤中也有表达。根据已发表的数据，24.5％的实体瘤也是CD30+，最显著的是生殖细胞肿瘤(肌纤维母细胞肉瘤(93％)、胚胎癌(77％)、间皮瘤(77％)、混合生殖细胞瘤(GCT)(65％)、头颈部癌(24％)、卵黄囊瘤(18％)、血管肉瘤(14％)、垂体腺瘤(11％)和精原细胞瘤(6％)，增加了针对其他肿瘤的CD30靶向治疗的可能性(6)。
[0005]虽然90％的早期HL患者可以通过常规治疗治愈，但只有70％的晚期患者可以通过标准治疗方法治愈。对于复发的HL患者，只有一半的患者被标准的补救疗法治愈(7)。
[0006]用单克隆抗体靶向CD30治疗霍奇金淋巴瘤(HL)和间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL)在临床上取得了巨大成功。然而，主要由嵌合抗体的毒素成分介导的不良事件导致许多患者停止治疗。用表达CD30特异性嵌合抗原受体(CAR)的T细胞靶向CD30可减少副作用并增强抗肿瘤活性。
[0007]通过CAR靶向CD30的免疫治疗方法已经在临床前模型中证明了价值(8, 9)，并且在两个不同的独立临床试验中得到证实(10,11)，虽然临床受益不是最佳的。
[0008]第一代抗CD30 CAR T细胞是在20世纪90年代开发的，临床前研究证明了这些细胞能够在体外裂解表达CD30的HL细胞系(12,13)的能力。事实上，用抗CD30 CAR转导的Epstein
–
Barr病毒特异性细胞毒性T细胞在体外和体内小鼠异种移植模型中显示出抗CD30+癌细胞系的活性，改善了T细胞在体内的持久性(8)。
[0009]值得注意的是，在清除CD30+淋巴瘤细胞的同时，可溶性CD30的存在并没有减弱细胞裂解，这表明CD30从HL细胞脱落到血液中不会抑制体内抗CD30 CAR T细胞的功效(14)。
[0010]在第一次试验中，观察到淋巴瘤的反应不一致，大多数患者在多次输注CART细胞后疾病表现稳定，或者根本没有反应。总的来说，淋巴结比结外病变表现出更好的反应，肺部病变的反应似乎相对较差，并且输注的CAR T在输注后没有存留超过60天。值得注意的
是，几项临床数据(15,16)清楚地表明，在体内存留的CAR-T细胞与接受治疗的患者的更好结果相关。如表1中所总结的，在所描述的第一次临床试验中，作者考虑了携带第二代CAR的慢病毒平台，其特征在于来源于AJ878606.1杂交瘤的特异性针对CD30抗原的单链可变区片段(scFv) 序列、来源于人CD137的共刺激结构域与CD3ζ信号转导结构域(10)在同一阅读框。
[0011]抗CD30 CAR T细胞的第一个开放标记I期临床试验涉及18名复发或顽固的霍奇金淋巴瘤患者，该试验用慢病毒载体进行基因修饰以表达CD137共刺激域。所述18例患者包括1例原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和17例3 种不同亚型的霍奇金淋巴瘤，其中大多数为结节性硬化症。13名患者接受了1 个周期的CAR T细胞输注，5名患者接受了2个周期。
[0012]这项研究的初步结果表明，7例获得部分缓解，6例病情稳定。客观反应率为39％(10)。
[0013]在第二次试验中，大多数患者接受了CD30.CAR T细胞的多次输注，获得暂时缓解，并且输注后6周，不能再检测到CD30.CAR T细胞。如表1中所总结的，在该临床试验中，作者考虑了携带第二代CAR的逆转录病毒平台，其特征在于来源于HRS3杂交瘤的特异性针对CD30抗原的单链可变区片段(scFv)序列、来源于人CD28的共刺激域与CD3ζ信号转导结构域在同一阅读框。
[0014]表1
[0015][0016]特别地，在第二次临床试验中，9名复发/顽固的HL或ALCL患者被输注自体T细胞，所述自体T细胞用逆转录病毒载体进行基因修饰以表达CD30特异性CAR(CD30.CAR-T)，并编码CD28共刺激胞内域。值得注意的是，这些患者中有7人患有本妥昔单抗顽固性疾病。这项研究的初步结果显示，9名患者中有3名患者完全缓解，3名患者病情暂时稳定。在这项研究中，CAR-T细胞存留<8周，但肿瘤活检显示，其能有效地将T细胞转运到淋巴瘤部位(11)。
[0017]两项临床试验都表明多次CD30.CAR-T细胞输注耐受性良好。CAR-T输注前的宿主淋巴结清除术将有利于进一步改善CAR T细胞的扩增及其抗肿瘤活性。更重要的是，所述CAR-T细胞的存留与临床反应相关。
[0018]所有这些数据表明，CD30.CAR-T细胞是安全的，并可导致HL患者的临床反应，尽管有必要进一步优化该疗法以实现更长的体内存留和更高的抗肿瘤控制，尤其是在淋巴瘤复发时。
[0019]特别地，该方法的优化应考虑到经典霍奇金淋巴瘤(cHL)和间变性大T细胞淋巴瘤的特征在于仅少数恶性Reed-Sternberg及霍奇金细胞(HRS)和大量炎性细胞。这些非恶性细胞产生参与肿瘤免疫逃避的可溶性或膜结合分子。此外，HL 肿瘤产生的趋化因子环境会显著影响何种T细胞亚型在肿瘤中迁移和积聚(17)。事实上，HRS细胞产生趋化因子TARC和MDC，它们吸引辅助性T细胞(Th2) 和调节性T细胞(Tregs)，后者表达这些趋化因子的受体CCR4。在包括HL在内的肿瘤中的Tregs(和Th2细胞)的大量存在，通过削弱少数能够到达肿瘤部位的细胞毒性效应T淋巴细胞的抗肿瘤活性，产生了一种不利的免疫微环境。CCR4 在CD30特异性嵌合抗原受体(CAR-CD30)上的强制表达改善了CAR-CD30 T-重定向的效应T淋巴细胞向HL产生的TARC梯度的迁移(9)。HRS细胞通常表达高水平的PDL1，并产生免疫抑制性IL-10、TGF-β、半乳糖凝集素1和前列腺素E2，它们本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.CD30嵌合抗原受体，其从N末端到C末端包含或由以下物质组成:a)信号肽，例如包含或由MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)组成的信号肽，其通过第一接头连接到；b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，其包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头连接，或由其组成；c)可追踪标记，其选自由如下组成的组：ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)、ΔCD19:PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK(SEQ ID NO:5)、NGFR:KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(SEQ ID NO:6)，优选地为ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)；d)铰链，其选自由如下组成的组：铰链CD8 α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)、铰链CD28:IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:8)、铰链CH2-CH3:ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:9)、铰链CH3:ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10)，优选地为铰链CD8α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)；e)跨膜结构域，其选自由如下组成的组：CD28TM:FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:13)、CD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，优选地为CD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)；和f)共刺激信号结构域，其选自由如下组成的组：通过连接CD28胞质序列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、CD137(4-1BB)序列:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22)、和CD3-Zeta链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列，或通过连接CD28胞质序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、OX40序列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:24)和CD3Zeta 链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列。2.根据权利要求1所述的CD30嵌合抗原受体，其中连接AC10 VL和VH序列的第二接头选
自由如下组成的组：富含脯氨酸的刚性接头，如小鼠igG3上铰链(mIgG3UH):PKPSTPPGSS(SEQ ID NO:15),(mIgG3UH)2:PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS(SEQ ID NO:16)；或者富含甘氨酸的柔性接头，如(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17),(G4S)4接头:GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18),G4SG2接头GGGGSGG(SEQ ID NO:19)或G3SG4接头:GGGSGGGG(SEQ ID NO:20)，优选GGGSGGGG(SEQ ID NO:20)。3.根据权利要求1-2中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中所述AC10VH序列和所述可追踪标记序列通过序列GS的第三接头连接。4.根据权利要求1-3中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域序列和共刺激信号结构域序列通过一个或多个接头连接，所述接头包含CD8a胞质(细胞):LYCNHRN(SEQ ID NO:25)或EF或由CD8a胞质(细胞):LYCNHRN(SEQ ID NO:25)或EF组成。5.根据权利要求1-4中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中:a)信号肽，其包含MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)或由其组成，该信号肽通过第一接头连接至:b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17)连接，或由其组成；c)包含ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)或由其组成的可追踪标记；d)铰链CD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)；e)跨膜结构域CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，其通过一个或多个包含接头CD8a胞质(细胞)：LYCNHRN(SEQ ID NO：25)或由其组成的接头连接至：f)共刺激信号结构域，其由通过连接CD28胞质序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、OX40序列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:24)和CD3Zeta链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列组成。6.根据权利要求1-4中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中:a)信号肽，其包含MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)或由其组成，该信号肽通过第一接头连接至:b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17)连接，或由其组成；c)可追踪标记，其包含ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)或由其组成；d)铰链CD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)；
e)跨膜结构域CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，其通过一个或多个包含CD8a胞质(细胞)：LYCNHRN(SEQ ID NO：25)或由其组成的接头连接至：f)共刺激信号结构域，其由通过连接CD28胞质序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、CD137(4-1BB)序列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22)和CD3Zeta链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列组成。7.根据权利要求1-4、6中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中所述CD30嵌合抗原受体是:MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：比亚吉奥，
申请(专利权)人：耶稣圣婴儿童医院，
类型：发明
国别省市：